m iR-520c-3p介导的血管内皮生长因子A低表达对乳头状甲状腺癌细胞增殖、运动和血管再生的影响及其机制

邵建斌，方因，文霆，杨梅兰

1.厦门大学附属第一医院普外科福建厦门 361000；

2.厦门市思明区开元街道社区卫生服务中心健教科福建厦门 361000

甲状腺癌（thyroid cancer）是一种常见的内分泌相关肿瘤，研究显示，其发病率有逐渐上升趋势，且发病年龄越来越年轻化［1-2］。目前研究证明，甲状腺癌可按其病理分类，主要分为4个类型：乳头状甲状腺癌、滤泡状甲状腺癌、髓样甲状腺癌和未分化甲状腺癌［3-4］。目前的治疗方式包括内分泌治疗、化疗、基因治疗以及手术治疗，但手术后副作用较大，患者通常需终生服用甲状腺素片，因此，基因治疗成为目前较为关注的治疗方法之一［5-7］。miR-520c-3p被认为是肿瘤生长的负调节因子，与肿瘤的增殖、运动凋亡密切相关［8-9］。LEI等［10］研究表明，miR-520c-3p可抑制肝癌细胞的增殖，并促进其凋亡。张灵敏等［11］研究表明，miR-520c-3p可抑制结直肠癌细胞的恶性生物学特征。由此推测，miR-520c-3p对乳头状甲状腺癌细胞的增殖、运动和血管再生也有一定影响。

本研究旨在探讨miR-520c-3p介导的血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）对乳头状甲状腺癌细胞增殖、运动和血管再生的影响及其机制，为甲状腺癌的治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1细胞及质粒 乳头状甲状腺癌细胞B-CPAP由中科院协和细胞库提供；miR-520c-3p mimic、pcDNA-VEGFA、VEGFA野生及突变质粒（Luc-VEGFA 3′UTR wt和Luc-VEGFA 3′UTR mut）由上海禾午生物科技有限公司提供。

1.2主要试剂及仪器 双荧光素酶报告基因试剂盒、HRP标记的山羊抗兔/鼠抗体和ECL发光剂购自上海碧云天生物技术有限公司；兔源VEGFA、Ki67、PCNA、E-cadherin抗体、Vimentin抗体及鼠源GAPDH抗体购自美国Abcam公司；RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国Hyelone公司；CCK-8检测试剂盒购自南京莱富赛生物科技有限公司；Transwell小室购自美国Corning Coseter公司；蛋白电泳及转膜仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3细胞培养 用含100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37℃，5%CO2培养箱内培养B-CPAP细胞，待细胞生长至对数生长期时进行后续试验。

1.4细胞转染及分组处理 将B-CPAP细胞分为Control、NCmimic、miR-520c-3p mimic、pcDNA vector、VEGFA和mimic+VEGFA组，其中Control组不做任何处理，NC mimic组转染mimic阴性对照物，miR-520c-3p mimic组单独转染miR-520c-3p mimic，pcDNA vector组转染pcDNA vector，VEGFA组转染pcDNA-VEGFA，mimic+VEGFA组联合转染miR-520c-3p mimic和pcDNA-VEGFA。该部分试验由上海基尔顿生物科技有限公司完成。

1.5靶向关系的验证 利用生物信息学软件Target Scan 7.2预测VEGFA是否为miR-520c-3p的结合片段。将VEGFA野生及突变质粒（Luc-VEGFA 3′UTRwt和Luc-VEGFA 3′UTRmut）分别与NCmimic、miR-520c-3p mimic转染B-CPAP细胞，使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组的荧光素酶活性。

1.6相关基因表达水平检测 采用RT-PCR法。提取各组细胞总RNA，反转录合成cDNA，以其为模板进行PCR扩增，采用2-ΔΔCt法计算RNA的相对表达量，以GADPH为内参。miR-520c-3p基因上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAAAGUGCTTCCTTT-3′，下游引 物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACCCTCTA-3′［12］；GAPDH基因上游引物：5′-GGTATCGTGGAAGGACTC-3′，下游引物：5′-GTAGAGGCAGGGATGATG-3′；VEGFA基因上游引物：5′-VEGFAGACGGACAGACAGACAGACAC-3′，下游引物：5′-CCGCCTCGGCTTGTCACAT-3′［13］。引物由武汉源深生物科技有限公司合成。

1.7相关蛋白表达水平检测 采用Western blot法。取各组B-CPAP细胞，4℃恒温条件下12 000×g离心10 min，加入裂解液裂解后，加入Loading Buffer缓冲液，测定蛋白浓度。经10%SDS-PAGE分离总蛋白，转移至PVDF膜上，置于5%脱脂牛奶中室温封闭2 h；分别加入兔源VEGFA（1∶1 000稀释）、Ki67（1∶1 500稀释）、PCNA（1∶1 000稀释）、E-cadherin（1∶2 000稀释）、Vimentin（1∶1 000稀释）抗体及鼠源GAPDH抗体（1∶1 000稀释），4℃孵育过夜；TBS洗膜5次，8 min/次，加入HRP标记的山羊抗兔/鼠抗体（1∶2 000稀释），室温孵育1 h；TBST洗膜5次，8 min/次，滴加ECL发光剂，暗室中发光显影。以GADPH为内参，目的蛋白条带与内参条带灰度值的比值为相对蛋白表达水平。

1.8细胞增殖能力的检测 采用CCK-8法。取各组细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，接种于96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养，分别于1、2、3、4 d进行CCK-8检测，按照试剂盒说明书操作，酶标仪测波长为570 nm。

1.9细胞侵袭能力的检测 采用Transwell小室试验。用移液器在PVPF聚碳酸滤膜外表面均匀涂抹纤粘连蛋白，膜内侧涂matrigel。取各组细胞，按2×105个/孔接种于Transwell小室，37℃，5%CO2培养4 h；去除小室中膜内侧表面多余的细胞，用多聚甲醛固定，于显微镜400倍视野下随机选取10个视野，双盲计数法统计膜下表面的细胞数平均值，试验重复3次。

1.10微管结节数检测 采用微管形成试验。取各组细胞，按1×105个/mL接种于铺Matrigel基质胶的24孔板上，37℃，5%CO2培养，每隔4 h在显微镜下观察B-CPAP细胞的微管样结构，继续培养16 h后，计数细胞微管形成数目。

1.11统计学分析 采用SPSS 22.0软件对试验数据进行统计学分析，利用Graph Pad Prism 5软件作图，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1靶向关系的验证 生物信息学软件预测结果显示，miR-520c-3p与VEGFA 3′UTR192-198位点处存在结合位点，见图1。双荧光素酶报告基因检测结果显示，各组细胞荧光素酶相对活性差异有统计学意义（F=70.374，P＜0.001），其中与Luc-VEGFA 3′UTR wt+NC mimic组比较，共转染Luc-VEGFA 3′UTR wt与miR-520c-3p mimic组细胞中荧光素酶相对活性明显降低（t=16.706，P＜0.001），见图2。各组细胞miR-520c-3p表达水平差异有统计学意义（F=186.788，P＜0.001），其中与NC mimic组比较，miR-520c-3p mimic组miR-520c-3p表达水平明显升高（t=23.676，P＜0.001），见图3。

图2 双荧光素酶报告基因检测各组B-CPAP细胞的荧光素酶活性Fig.2 Determination of luciferase activities of B-CPAPcells in various groups by dual luciferase reporter gene assay

注：红色处表示结合位点。

图3 靶向关系验证试验各组B-CPAP细胞中miR-520c-3p的表达水平Fig.3 Expression levels of miR-520c-3p in B-CPAP cells of various groups in verification for targeting relationship

2.2各组B-CP A P细胞miR-520c-3p及VE GFA表达情况

2.2.1基因表达水平 各组细胞miR-520c-3p的表达水平差异有统计学意义（F=422.931，P＜0.001），与Control组比较，miR-520c-3p mimic组miR-520c-3p表达水平明显升高（t=40.989，P＜0.001），VEGFA组miR-520c-3p表达水平明显降低（t=9.624，P＜0.001）；与VEGFA组比较，mimic+VEGFA组miR-520c-3p表达水平明显升高（t=12.574，P＜0.001），见图4。各组细胞VEGFAmRNA的表达水平差异有统计学意义（F=197.540和345.011，P均＜0.001），其中与pcDNA vector组比较，VEGFA组VEGFAmRNA的表达水平明显升高（t=24.382，P＜0.001）；与Control组比较，miR-520c-3p mimic组VEGFAmRNA的表达水平明显降低（t=7.815，P＜0.001）；与VEGFA组比较，mimic+VEGFA组VEGFAmRNA的表达水平明显降低（t=32.117，P＜0.001）。见图5。

图4 靶向关系验证试验各组B-CPAP细胞中miR-520c-3p的表达水平Fig.4 Expression levels of miR-520c-3p in B-CPAP cells of various groups in verification for targeting relationship

图5 各组B-CPAP细胞中VEGFA mRNA的表达水平Fig.5 Expression levels of VEGFA mRNA in cells of various groups

2.2.2蛋白表达水平 各组细胞VEGFA蛋白表达水平差异有统计学意义（F=55.265，P＜0.001），与Control组比较，miR-520c-3p mimic组VEGFA蛋白表达水平明显降低（t=3.894，P=0.014），VEGFA组VEGFA蛋白表达水平明显升高（t=13.274，P＜0.001）；与VEGFA组比较，mimic+VEGFA组VEGFA蛋白表达水平明显降低（t=12.389，P＜0.001）。见图6和图7。

图6 Western blot分析各组B-CPAP细胞中VEGFA蛋白的表达Fig.6 Western blotting of VEGFA expressions in B-CPAP cells of various groups

图7 各组B-CPAP细胞中VEGFA蛋白的表达水平Fig.7 Expression levels of VEGFA protein in B-CPAPcells of various groups

2.3miR-520c-3p介导VE GFA对B-CP A P细胞增殖能力的影响

2.3.1细胞增殖活性 各组细胞培养4 d时的增殖活性差异有统计学意义（F=43.561，P＜0.001），与Control组比较，miR-520c-3p mimic组细胞增殖活性明显降低（t=5.379，P=0.002），VEGFA组细胞增殖活性明显升高（t=10.489，P＜0.001）；与VEGFA组比较，mimic+VEGFA组细胞增殖活性明显降低（t=9.548，P＜0.001）。见图8。

图8 各组B-CPAP细胞的增殖活性Fig.8 Proliferation activities of B-CPAP cells in various groups

2.3.2增殖相关蛋白的表达 各组细胞Ki67和PCNA蛋白的表达水平差异有统计学意义（F分别为147.127和82.599，P＜0.001），与Control组比较，miR-520c-3p mimic组Ki67和PCNA蛋白的表达水平均明显降低（t分别为5.914和5.506，P分别为＜0.001和0.001），VEGFA组Ki67和PCNA蛋白的表达水平均明显升高（t分别为22.179和15.733，P均＜0.001）；与VEGFA组比较，mimic+VEGFA组Ki67和PCNA蛋白的表达水平均明显降低（t分别为18.647和14.859，P均＜0.001）。见图9和图10。

图9 Western blot分析各组B-CPAP细胞中增殖相关蛋白的表达Fig.9 Western blotting of expressions of proliferationassociated proteins in B-CPAPcells of various groups

图10 各组B-CPAP细胞中增殖相关蛋白的表达水平Fig.10 Expression levels of proliferation-associated proteins in B-CPAPcells of various groups

2.4miR-520c-3p介导VE GFA对B-CP A P细胞侵袭能力的影响

2.4.1细胞侵袭能力 各组细胞侵袭数差异有统计学意义（F=45.865，P＜0.001），与Control组比较，miR-520c-3p mimic组细胞侵袭数明显降低（t=8.606，P＜0.001），VEGFA组细胞侵袭数明显升高（t=7.934，P＜0.001）；与VEGFA组比较，mimic+VEGFA组细胞侵袭数明显降低（t=9.144，P＜0.001）。见图11和图12。

图11 各组B-CPAP细胞侵袭能力的显微镜观察（×400）Fig.11 Microscopy of invasion abilities of B-CPAP cells in various groups（×400）

图12 各组B-CPAP细胞的侵袭能力Fig.12 Invasion abilities of B-CPAPcells in various groups

2.4.2侵袭相关蛋白的表达 各组细胞E-cadherin和Vimentin蛋白的表达水平差异有统计学意义（F分别为62.296和51.111，P均＜0.001），与Control组比较，miR-520c-3p mimic组E-cadherin蛋白的表达水平明显升高，Vimentin蛋白的表达水平明显降低（t分别为14.935和3.770，P分别为＜0.001和0.043），VEGFA组E-cadherin蛋白的表达水平明显降低，Vimentin蛋白的表达水平明显升高（t分别为5.384和12.147，P均＜0.001）；与VEGFA组比较，mimic+VEGFA组E-cadherin蛋白的表达水平明显升高，Vimentin蛋白的表达水平明显降低（t分别为3.849和13.822，P分别为0.038和＜0.001）。见图13和图14。

图13 Western blot分析各组B-CPAP细胞中侵袭相关蛋白的表达Fig.13 Western blotting of invasion-associated proteins in B-CPAPcells of various groups

2.5miR-520c-3p介导VE GFA对B-CP A P细胞微管形成的影响 各组细胞微管结节数差异有统计学意义（F=45.412，P＜0.001），与Control组比较，miR-520c-3p mimic组细胞微管结节数明显降低（t=6.336，P＜0.001），VEGFA组细胞微管结节数明显升高（t=10.031，P＜0.001）；与VEGFA组比较，mimic+VEGFA组细胞微管结节数明显降低（t=8.975，P＜0.001）。见图15和图16。

图15 各组B-CPAP细胞微管结节数的显微镜观察（×100）Fig.15 Microscopy of numbers of microtubule nodules in B-CPAPcells of various groups（×100）

图16 各组B-CPAP细胞的微管结节数Fig.16 Numbers of microtubule nodules in B-CPAP cells of various groups

3 讨论

VEGFA是VEGF的一个亚型，也是对血管内皮细胞增殖和分化影响最大的亚型，多项研究表明［14-15］，VEGFA在实体瘤和血液肿瘤中异常高表达，参与肿瘤的发生发展。本研究利用生物信息学软件预测VEGFA为miR-520c-3p的靶基因，并通过双荧光素酶报告基因检测验证其靶向关系。为进一步验证转染效率，采用B-CPAP细胞单独或联合转染miR-520c-3p mimic和pcDNA-VEGFA，经Western blot和RTPCR检测发现，VEGFA组VEGFAmRNA相对表达水平较对照组显著升高，miR-520c-3p mimic组miR-520c-3p相对表达水平显著升高，VEGFA mRNA及蛋白相对表达水平显著降低；与VEGFA组比较，联合转染的mimic+VEGFA组VEGFA mRNA及蛋白相对表达水平均显著降低，miR-520c-3p相对表达水平显著升高。表明成功地将miR-520c-3p和VEGFA导入了B-CPAP细胞中。

肿瘤的恶性生物学特征包括恶性增殖、侵袭与转移等，其中肿瘤的恶性增殖与相关蛋白和增殖相关蛋白密切相关［16-17］。Ki67是一种重要的增殖相关蛋白，当Ki67高表达时，细胞的有丝分裂加速［18］。PCNA是增殖细胞核抗原，与细胞增殖分化密切相关，当PCNA高表达时，细胞增殖加速［19］。本研究通过CCK-8染色试验发现，miR-520c-3p mimic组细胞增殖活性显著降低，表明miR-520c-3p mimic可明显抑制B-CPAP细胞增殖活性。为了探究其机制，本研究采用Western blot法检测增殖相关蛋白的表达，与VEGFA组比较，mimic+VEGFA组Ki67和PCNA蛋白表达水平显著降低，表明miR-520c-3p可靶向抑制VEGFA表达，并下调增殖相关蛋白表达，使B-CPAP细胞的增殖受到抑制。李庆贺等［20］研究表明，长链非编码RNA可通过靶向下调VEGFA表达，进而抑制癌细胞增殖、侵袭和迁移，并促进细胞凋亡，与本研究得到的结论相类似。

肿瘤的侵袭与转移也是其重要的恶性生物学特征，这种特征受上皮间质转化（epithelial mesenchyml transition，EMT）可使得上皮细胞极性丧失并获得移动能力［21-23］。EMT过程受相关蛋白的调控，如Ncadherin、E-cadherin及Vimentin等［24］。E-cadherin为E-钙黏蛋白，也是调节EMT过程的重要蛋白，Ecadherin减少会使间质细胞标志物如Vimentin、纤联蛋白等表达上调，使得上皮细胞失去黏附连接作用，增强细胞的侵袭及转移能力［25-26］。本研究通过Transwell检测细胞侵袭情况，发现mimic+VEGFA组侵袭迁移能力显著降低。为了验证其作用机制，本研究采用Western blot检测相关蛋水平白的表达，结果显示，与VEGFA组比较，mimic+VEGFA组Vimentin蛋白表达量显著降低，E-cadherin蛋白表达水平显著升高，表明miR-520c-3p介导VEGFA低表达可通过EMT过程抑制肿瘤细胞的运动能力。这与方淑芬等［27］研究指出下调VEGFA的表达可调控肿瘤细胞的EMT过程的结论相类似。

综上所述，本研究结果表明，miR-520c-3p可通过介导VEGFA低表达实现抑制甲状腺癌细胞增殖和运动的能力。