基于SCoT 标记的大豆种质遗传多样性研究

王雪娇，苏二虎，贾利敏，赵晓宇，郭嘉华，周宇，王新华，李强

（内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031）

大豆起源于我国，栽培历史悠久，经长期自然进化、人工驯化，产生了丰富的遗传种质资源[1]。目标起始密码子多态性（Start codon targeted polymorphism，SCoT）标记是2009 年Collard 等[2]发明的新型目的基因分子标记，其原理是根据植物基因中的ATG 翻译起始位点侧翼保守序列，设计18bp 单引物对基因组进行扩增，可能产生候选功能基因区的多态性标记。它结合了ISSR、RAPD 标记的优点，成本低廉、操作简单、多态性高、通用性强，可获得丰富的遗传信息，并能有效的产生与性状关联的分子标记，有利于辅助育种[3]；SCoT 标记不仅可以作为SSR、ISSR、AFLP、RAPD 的有效补充，而且是一种能跟踪性状的新的分子标记[4]。目前已在水稻、龙眼、芒果、花生、罗汉松、葡萄等作物上应用[5-9]。该次试验对151 份大豆种质进行了多态性扩增，分析品种间、不同地理来源群体间的遗传关系，以期为今后的标记辅助育种及性状关联位点的发掘奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取151 份国内外不同地理来源大豆代表性品种。国内品种主要来源于黑龙江42 个、吉林40 个、内蒙古15个、辽宁9 个、其他省区13 个、国外品种32 个。

1.2 SCoT 引物及PCR 反应体系

82 个SCoT 引物，1～36 号引物参照Collard 等[2]，37～80号引物参照Luo 等[6]，81～82 号引物参照熊发前等[7]设计的引物，所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。SCoT-PCR 反应体系为20 μL，包括Mg2+浓度2.0 mmol/L、dNTPs 浓度为0.2 mmol/L、Taq 酶用量为1.5 U、引物浓度为0.250 μmol/L、DNA 模板用量为30 ng。

1.3 电泳及检测

取10 μL 扩增产物，加入2 μL 6×loading buffer，在1.5%琼脂糖凝胶（含核酸染料）中电泳，以D2000 Marker作标准分子质量进行对照，在SN-NJ0601 凝胶成像系统观察记录并采集图像。

1.4 数据统计与分析

采用人工识别的方法，对清晰稳定的主带进行统计，在相同迁移位置上有带赋值为“1”，无带赋值为“0”，建立原始数据矩阵。

用Excel 2003 计算总条带数多态性条带数、多态性条带百分率及多态性信息含量。应用Popgene1.32 软件计算有效等位基因数（Ne）、Nei’s 基因多样性指数（H）、香农信息指数（I）、不同群体间的Nei’s 遗传一致度和遗传距离等，并根据Nei’s 遗传一致度采用非加权成对算术平均法（UPGMA）在Ntsys-pcVer.2.10 软件中绘制群体间聚类关系图。应用POWERMARKER Version 3.25 软件根据Nei’s（1983）遗传距离，绘制个体间聚类图。

2 结果与分析

2.1 SCoT 引物筛选及多态性分析

结合图1 和表1 可以看出，82 条引物中有41 条引物能扩增出清晰且丰富的多态性条带，共扩增出275 个条带，其中，182 个具有多态性，多态性条带百分率为66.18%。引物的多态性变幅为46.15%～100.00%，每条引物检测的位点数为1～13 个，平均位点数为6.71 个，平均多态性位点4.44 个；不同引物的总条带数、多态性条带数差异较大，总带数最多的引物是SC34、SC63，都为13 条；多态性条带数最多的引物是SC17，为9 条；多态性条带百分率最大的引物是SC21、SC82，均为100%，最低的是SC34，为46.15%。不同引物的多态信息含量（PIC）的变异范围为0.246～0.956，平均为0.656，表明SCoT 标记能较好地反映151 份大豆品种的遗传多样性。

图1 引物SC31 对18 个大豆品种的SCoT-PCR 扩增结果

表1 SCoT 引物在151 个大豆种质中的扩增结果及多态性

2.2 不同地理来源大豆品种的遗传多样性分析

从表2 可知，大豆资源品种群水平上的遗传多样性高于6 个地理来源群体的平均水平。品种群水平上的有效等位基因数（Ne）、Nei’s 基因多样性指数（H）和香农信息指数（I）分别为1.7227、0.4081 和0.5948；不同地理来源群体水平上分别为1.6657、0.3812 和0.5619；说明不同地理来源大豆群体的遗传多样性有较大的差异。6 个不同地理来源大豆品种的有效等位基因数（Ne）变异在1.647 5～1.685 1，辽宁的有效等位基因数（Ne）最多，为1.685 1，接下来依次为国外、其他省区、吉林、黑龙江、内蒙古。Nei’s 基因多样性指数（H）是衡量品种间遗传多样性最常用的指标之一，能够反映物种等位基因的丰富度和均匀程度，其变异范围为0.373 2～0.387 9，表现为辽宁>国外>吉林>其他省区>黑龙江>内蒙古；香农信息指数（I）变异范围为0.552 4～0.568 2，表现为辽宁>国外>吉林>其他省区>黑龙江>内蒙古；各项指标均以辽宁最高，内蒙古最低。综合比较分析各项遗传多样性指数可以看出，黑龙江和内蒙古品种的遗传多样性较低，辽宁和国外品种具有较高的遗传多样性。

表2 不同地理来源群体遗传多样性分析

2.3 不同地理来源大豆品种群的遗传一致度和聚类分析

从表3 可以看出，6 个大豆地理来源群的遗传一致度分布为0.860 4～0.965 7，平均为0.920 4，其中内蒙古和黑龙江大豆种质群的遗传一致度最高，为0.965 7，遗传距离最近；而国外和其他省区大豆种质群遗传一致度最低，为0.858 0，遗传距离最远。

表3 基于SCoT 标记的不同地理来源大豆种质群的遗传一致度和遗传距离

为了进一步揭示不同地理来源群体的亲缘关系，根据种质群间的Nei’s 遗传一致度，利用UPGMA 法进行聚类分析，从图2 可以看出，遗传相似系数在0.925 处6 个种质群明显的分为2 大类，即国内和国外品种，表明国内外大豆品种间的亲缘关系相对较远。进一步细分，国内群在遗传相似系数为0.937 处，又可分为3 个亚类，即：黑龙江、内蒙古、吉林品种聚为一类，辽宁、其他省区品种各为一类。聚类结果与地理分布有一定的相关性。

图2 基于SCoT 标记的6 个不同地理来源群体UPGMA聚类分析结果

2.4 参试大豆种质聚类分析

第Ⅰ类群共23 份材料，占参试材料的15.2%，包括其他省区9 个，吉林和辽宁各5 个，内蒙古3 个，国外1 个；第2 类群共33 份材料，占参试材料的21.9%，主要为国外品种，包括国外大豆品种26 个，占参试国外材料的81.3%，吉林4 个，黑龙江、辽宁、内蒙古各1 个。第Ⅱ类群主要为含有国外血缘的大豆品种，包括26 份国外引进材料，吉林的吉引81 号、黑龙江的嫩丰15 号、内蒙古的蒙豆14 等；吉林的公野03-5570、公野04-L15、吉育89 号都具有野生大豆血缘，国际上公认中国是大豆的起源国，初步推测国外大豆品种是由我国野生大豆驯化，因此血缘较近。第Ⅲ类群共95 份材料，占参试材料的62.9%，包括黑龙江41 个，吉林30 个，内蒙古11 个，国外5 个，辽宁和其他省区各4 个。

由图3 进一步可以看出，国内、外品种明显的分开，如：第Ⅱ类群33 份材料中有26 份为国外品种，表明国内、外种质资源遗传基础差异较大；具有野生大豆血缘的品种与国外种质聚为一类，如：第Ⅱ类群中的公野03-5570、公野04-L15、吉育89 等与国外品种聚在一起；地方品种和育成品种明显分开，小粒、褐色种皮、黑色种皮大豆等地方品种大多聚为一类，如：第Ⅲ类群的第三亚类11 份材料有10 份为地方品种；具有共同血缘的品种大多聚在一起，如：第Ⅲ类群的第二亚类中，具有金元血缘的元宝金、荆山璞、丰收6 号、牡丰1 号聚在一起；具有合丰35 血缘的黑农53、合丰47、合丰50 聚在一起；相同育种单位品种大多聚在一起，如：吉林49 与吉育72、黑农53 与黑农2号、公野03-5570 与公野04-L15 等聚在一起；辽宁品种与其他省区品种大多聚为一类。

图3 151 份大豆种质基于SCoT 位点的UPGMA 聚类结果

3 讨论与结论

Collard 等[2]认为，在水稻种质资源及回交群体中SCoT标记多态性丰富，是一种实用、有效的方法，特别是对缺乏基因组信息的物种更具特殊价值；韩国辉等[10]在柑橘中也得到了类似的结果；该次研究也利用SCoT 标记分析了大豆种质资源及F2 后代材料，品种间、后代中多态性丰富；罗聪等[6]开展了芒果SCoT 和ISSR 分子标记比较研究，发现SCoT 分子标记多态性条带比率高于ISSR 分子标记，其聚类结果比ISSR 标记更能准确反映芒果品种间的亲缘关系；熊发前等[7]研究发现，SCoT 标记在花生属试材中多态性丰富，多态性比率达67.01%，而在花生栽培种中只有33.84%，栽培种花生遗传基础狭窄；本研究也证实了SCoT 标记在检测多态性位点上明显强于ISSR 标记，与罗聪的结果一致。郭大龙等[9]利用SCoT 标记研究葡萄遗传多样性指出，SCoT 标记多态性高达93.1%，引物平均PIC 为0.82，能很好的检测葡萄遗传变异信息；该次研究引物多态性比率为66.18%，引物平均PIC 为0.656，较郭大龙等结果略低，不同物种中SCoT 标记检测的遗传变异信息存在一定的差异。

该次研究聚类分析发现，国内、外品种明显的分开，表明国内、外种质资源遗传基础差异较大，可以利用国外种质拓宽中国大豆遗传基础；具有野生大豆血缘的国内育成品种与国外种质聚为一类；地方品种和育成品种明显分开，小粒、褐色种皮、黑色种皮大豆等地方品种大多聚为一类，这可能与这些地方品种含有与籽粒大小、种皮颜色、品质、抗性等特异基因有关；具有共同血缘的品种大多聚在一起；相同育种单位品种大多聚在一起，这可能与育种者使用少数几个骨干亲本、后代选择经验相似及相同的种植环境有关；辽宁品种与其他省区品种大多聚为一类，可能因为都是中熟、中晚熟品种，各育种单位种质资源相互交流，且生态类型接近。SCoT 分子标记技术多态性水平较高，信息含量丰富，可有效揭示大豆种质资源的遗传多样性，该次研究结果可为大豆种质资源科学评价和利用提供理论依据和参考。