贵州野生动物园一例袋鼠产气荚膜梭菌的分离鉴定

陈阊峥 汤德元 杨志刚 张 森 韩超逸 晏仁潭 罗 柳

(贵州大学动物科学学院，贵阳，550025)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一种革兰氏阳性厌氧菌[1]，广泛分布于自然界，主要存在于人和动物的肠道中，一定条件下可以引起梭菌性肌坏死和肠毒血症等多种疾病[2]。因其可以分解肌肉组织中的糖分，产生大量的气体造成组织气肿，还可以产生荚膜，所以称为产气荚膜梭菌，也称魏氏梭菌。目前，产气荚膜梭菌已经检测出20多种毒素，其中最主要的5种致死毒素为α、β、β2、ε和ι，而根据所含毒素的不同，又可以将产气荚膜梭菌分为A型(α)、B型(α、β、ε)、C型(α、β)、D型(α、ε)和E型(α、ι)[3-4]。

赤大袋鼠(Macropusrufus)隶属袋鼠目(Diprotodontia)袋鼠科(Macropodidae)大袋鼠属，主要生活在澳大利亚和巴布亚新几内亚地区。2020年12月上旬，贵州野生动物园饲养的1只赤大袋鼠突然死亡，通过分析临床症状和病理变化，经过实验室诊断等，明确死因，为今后袋鼠的饲养和疾病预防工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

贵州野生动物园病死赤大袋鼠的心、肝、肺、肾脏和肠道等组织。

1.2 剖检

对病死赤大袋鼠病理解剖，观察心、肺、肾、肝、胰腺和肠道等组织的病理变化。

1.3 细菌分离纯化及镜检

在超净工作台内，无菌操作，使用接种环在心、肺、肝、肾、胰腺和肠道等病变组织处取样，接种于TSC固体培养基(购于广东环凯微生物科技有限公司)，37 ℃需氧和厌氧条件下培养24～48 h，挑取单个菌落接种于FTG培养基(购于广东环凯微生物科技有限公司)，放置于水浴摇床中，37 ℃培养24 h，并吸取菌液进行涂片，酒精灯干燥固定后使用革兰氏染色试剂盒染色镜检。

1.4 生化鉴定

操作参考肠道菌科生化鉴定管说明书(青岛海博生物技术有限公司)，在超净工作台内，用接种针取纯化后的菌液，依次接种于各个生化鉴定管内，包括半固体琼脂、鸟氨酸脱羧酶肉汤、赖氨酸脱羧酶肉汤、氨基酸脱羧酶对照、西蒙氏枸橼酸盐、硫化氢、尿素酶、蛋白胨水(色氨酸肉汤)、MR-VP、苯丙氨酸、甘露醇、肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇(侧金盏花醇)和棉子糖。

1.5 细菌分子生物学鉴定

在超净工作台内，按说明书使用细菌基因DNA提取试剂盒(购于北京天根生化科技有限公司)提取纯化后菌液的DNA，并以此为模板，根据相关参考文献[5]合成16S rDNA基因序列引物(表1)。采用PCR方法，对其16S rDNA基因目的片段扩增，反应体系：上、下游引物各1 μL，细菌DNA 2 μL，用mix补足25 μL。反应条件：98 ℃预变性10 min；98 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。将PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒，按说明书操作对目的条带回收，送至擎科生物公司测序。

1.6 产气荚膜梭菌分型

根据文献[5]设计相关毒力基因的特异性引物，以纯化细菌的DNA为模板，用PCR技术分别对不同毒素基因的目的片段进行扩增(表1)。其中α、β、ε和ι的反应条件是：98 ℃预变性10 min；98 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃终延伸6 min。β2的反应条件是：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，45 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。

表1 产气荚膜梭菌16S rDNA和主要毒素基因的特异性引物

1.7 药敏试验

将纯化菌液接种于培养基中并涂匀，选取青霉素、头孢氨苄、头孢曲松、新霉素、苯唑西林、卡那霉素氨苄西林、羧苄西林、丁胺卡那、四环素、多西环素、头孢唑林、米诺环素和庆大霉素等药敏纸片(购于杭州微生物试剂有限公司)，将药敏纸片贴于培养基上并标明药敏种类，具体操作方法参照说明书，将培养基置于37 ℃厌氧培养24～48 h，观察结果。

1.8 动物试验

选择10只生长状态大致相同的雄性小鼠，随机分成2组(实验组和对照组)，每组各5只。在超净工作台内，实验组每只小鼠腹腔注射0.2 mL FTG液体培养基内悬液，对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水，将2组小鼠放于相同条件下的2个鼠笼中饲养，观察小鼠状态。

2 结果与分析

2.1 剖检结果

剖检后，可见病死赤大袋鼠的肝脏明显肿大，边缘质脆，表面有斑点状出血；肠道内部严重出血，肠系膜淋巴结肿大；胰腺坏死；胃部充气膨胀，胃黏膜脱落、出血；心包囊内有大量积液。

2.2 细菌形态观察

培养24～48 h后，厌氧培养基中可见灰白色、表明光滑、湿润、半透明的菌落生长，具有溶血特征。将分离纯化后的细菌革兰氏染色，显微镜下可见细菌为革兰氏阳性，菌体呈短杆状，两端钝圆，有荚膜，初步鉴定为产气荚膜梭菌。

2.3 细菌生化特性鉴定结果

该细菌可以发酵棉子糖、蜜二糖、山梨醇和甘露醇等糖类，产生气体；MR-VP、尿素酶、西蒙氏枸橼酸盐和半固体琼脂等实验结果呈阴性(表2)。这些生化鉴定结果与产气荚膜梭菌的生物学特性相符，表明该菌极有可能是产气荚膜梭菌。

表2 生化试验结果

2.4 细菌分子生物学鉴定结果

以纯化细菌DNA为模板，使用16S rDNA特异性引物成功扩增产物，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得长度约为600 bp的片段条带(图1)，与目的片段的长度基本符合。通过测序分析，与GenBank公布的产气荚膜梭菌ATCC 13124标准菌株的16S rDNA核苷酸序列进行比较，发现二者的同源性高达99.33%，确定该细菌是产气荚膜梭菌。通过GenBank比对，发现该菌与炫舞梭菌(Clostridiumtarantellae)、撒丁岛梭菌(C.sardiniense)等菌株具有亲缘关系。使用MEGA 5.0软件中的NJ法构建进化树，可以看出分离株CCB与序列号为NR104741.1的菌株亲缘关系最接近(图2)。

图1 样品16S rDNA扩增结果Fig.1 Results of 16S rDNA amplification 注：M.DL2000 DNA Maker；1.阴性对照；2.样品 Note：M，DL2000 DNA Maker.1，Negative control.2，Sample

图2 产气荚膜梭菌16S rDNA基因核苷酸序列系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene nucleotide sequence of Clostridium perfringens

2.5 产气荚膜梭菌分型结果

以产气荚膜梭菌5种主要毒素基因的特异性引物进行PCR扩增，得到的产物置于1%琼脂糖凝胶电泳检测，只有毒素基因cpa扩增出了目的条带(图3)，长度约为324 bp，与目的片段基本符合。将其PCR产物测序后进行BLAST比对分析，结果显示，该序列与GenBank中的α毒素基因序列同源性达100%，证实其为产气荚膜梭菌α毒素，并确定了该分离菌株的分型为产气荚膜梭菌A型。

图3 产气荚膜梭菌毒素基因分型扩增结果Fig.3 Genotyping and amplification of Clostridium perfringens toxin 注：M.DL2000 DNA Marker；1.cpb基因；2.cpb2基因；3.cpa基因；4.etx基因；5.iap基因 Note：M，DL2000 DNA Marker.1，cpb gene.2，cpb2 gene.3，cpa gene.4，etx gene.5，iap gene

2.6 药敏试验结果

青霉素、苯唑西林、四环素、多西环素、米诺环素和红霉素对该菌形成的抑菌圈直径>24 mm(表3)，说明这些药物对产气荚膜梭菌的生长有极强的抑制作用。

表3 药敏试验结果

2.7 动物试验结果

试验组小鼠在48 h内全部死亡。通过解剖观察，死亡小鼠体内脏器产生大量气泡，肠道黏膜有严重充血、出血症状，肝脏充血肿大、质脆。挑取肠道内容物进行涂片染色，可见革兰氏阳性杆菌，为短杆状，两端钝圆，与注射的菌株形态相同。

3 讨论

本病例利用细菌分离鉴定、生化试验、PCR技术和药敏试验等方法，分离纯化得到1株产气荚膜梭菌A型毒株。在日常生活中，产气荚膜梭菌普遍存在于动物的肠道中，当动物身体健康、抵抗力较强时，肠道内的各种微生物菌群相对稳定，产气荚膜梭菌一般不会导致疾病[6]，只有当饲养条件达不到要求，饲料营养不均衡，抵抗力降低或发生应激反应时等[7]，产气荚膜梭菌才会大量繁殖，引起动物食物中毒、气性坏疽、肠毒血症，以及分泌性、坏死性和出血性肠炎，最终导致急性死亡。产气荚膜梭菌是条件致病菌，患病无明显的季节性，一般病程极短，很难得到有效治疗，病死率极高[8]。

根据药敏试验结果，产气荚膜梭菌对青霉素、四环素、多西环素和红霉素等药物极为敏感，与已报道的产气荚膜梭菌药敏试验结果相符，说明此类药物可用于临床上发病动物的治疗[9-10]。贵州冬季气候较冷，昼夜温差较大，极易导致袋鼠疾病的发生。在动物园的日常管理中，袋鼠要避寒保暖，加强饲养和清洁管理，定期对圈舍进行消毒，避免病原物滋生，确保饲料营养配比均衡，增强免疫力。当动物园内发生该疾病时，采集本地分离菌株，灭活后在全园动物中紧急接种[11]，可以有效避免该病在动物园内传播。