锁阳黄酮对氧化损伤大鼠肝细胞的影响

李岭，黄铭锐，郭嘉鑫，陈志

（青海师范大学，青海西宁 810008）

锁阳，首载于《本草衍义补遗》，为锁阳科植物锁阳（Cynomorium songaricumRupr.）的干燥肉质茎，又名不老药[1]。主要含有有机酸类、黄酮类、三萜类、糖苷类、甾体类、氨基酸及无机离子等多种生理活性物质，抗寒耐干旱[2-4]。现代医学研究证明，锁阳可提高机体的免疫能力、清除自由基、抑制人体免疫缺陷病毒[5]。

锁阳黄酮是指从锁阳中提取的黄酮单体。近年来，黄酮类化合物日益受到人们的青睐，各种富含黄酮类化合物的植物中草药资源相继被开发利用[6]。其中，(-)-表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯（EGCG）可以通过清除机体氧自由基、减少氧自由基过度生成、激活内源性抗氧化应激机制、免疫调节等多种分子机制避免肺实质细胞损伤[7]。

肝细胞氧化损伤是导致许多肝病，诸如脂肪肝、肝炎、肝硬化、肝纤维化和肝癌等，的重要原因之一。尽管临床上已有许多治疗肝病的药物，但是大多药物的有效性与毒副作用问题仍然存在。因此寻找新的天然药物，对于肝病的临床治疗具有重要意义。本研究通过探讨锁阳黄酮对过氧化氢诱导大鼠肝星状细胞氧化损伤的保护作用，以期为肝病的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

锁阳，购于青海省西宁市中药房；大鼠星状肝细胞，青海大学医学院提供；SDS、MTT，Sigma公司；PBS（pH 7.4），上海前尘生物科技公司；胰蛋白酶-EDTA、DMEM高糖培养基、胎牛血清，Hyclone公司；大鼠丙二醛（MDA）ELISA试剂盒、大鼠一氧化氮合酶（NOS）ELISA试剂盒、大鼠细胞蛋白ELISA试剂盒，上海酶联生物工程有限公司；HPD-722大孔吸附树脂，沧州宝恩化工有限公司；聚酰胺层析薄膜，上海慧颖生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯，购自天津致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BX43荧光显微镜，日本奥林巴斯公司；BSC-1500B2-X生物安全柜，济南圣科环保科技有限公司；Bio-Rad XMARK全自动酶标仪，上海闪谱生物科技有限公司；HF90二氧化碳培养箱，香港力康生物医疗科技控股有限公司；UV-1780紫外分光光度计，日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 锁阳黄酮提取及溶液配制

将锁阳粉碎后过100目筛，石油醚脱脂后所得残渣与5%NaOH溶液按1∶10的质量体积比进行配制，浸提3次，每次3 h，合并上清液。使用盐酸酸化后用氯仿萃取，浓缩有机层。将所得浸膏用HPD-722大孔吸附树脂富集锁阳黄酮，再经聚酰胺柱层析分离富集，收集50%～75%乙醇洗脱液合并浓缩，冷冻干燥得到锁阳黄酮粉末[8]。

提取物中总黄酮含量的测定按文献[9]中的方法并稍作修改。以浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，测定提取物中的黄酮含量（LCH，%），锁阳总黄酮含量（TFC，mg/g）计算方法如式（1）：

1.3.2 细胞培养

取大鼠肝星状细胞移至一次性培养瓶中，加入含有1%双抗、10%胎牛血清的细胞培养液，在37℃、5% CO2孵化箱中持续培育至对数生长期，后续实验所需的大鼠肝星状细胞均处于对数生长期。

1.3.3 过氧化氢溶液浓度的筛选

不同浓度的过氧化氢对大鼠肝星状细胞的损伤程度各有差异，因此考察不同氧化剂浓度对细胞的致损状况。考察过氧化氢浓度分别为200 μmoL/mL、400 μmoL/mL和800 μmoL/mL下大鼠肝星状细胞的活力。调整细胞浓度为1×105个/mL，向孔板中加入不同浓度的过氧化氢溶液，MTT法检测细胞活力。

1.3.4 锁阳黄酮溶液对细胞的保护效果

实验设立空白组、阴性对照组、过氧化氢损伤模型组（200 μmoL/mL）和锁阳黄酮（浓度分别为0 μg/mL、12.5 μg/mL、25.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL和200.0 μg/mL）给药组，每组3个复孔。37 ℃二氧化碳培养箱中培养1 h，在510 nm处测定OD值，每组实验重复3次。

1.3.5 MDA、NOS、蛋白浓度的测定

取对数生长期的大鼠肝星状细胞，用PBS洗涤后，经0.25%的胰酶消化离心去上清，调整细胞浓度。给药组分别加入25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的锁阳黄酮溶液，培养12 h后按试剂盒操作步骤测定细胞中MDA、NOS及蛋白浓度。

1.4 数据处理

所有数据用SPSS 21.0统计软件处理，数据用均数±标准差（±s）表示，采用t检验，P＜0.05视为差异具有统计学意义，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 锁阳黄酮含量的测定

芦丁标准曲线如图1所示，经统计处理得回归方程Y=12.120 5X-1.785 7×10-4，R2=0.999 9。根据标准曲线得提取物中的黄酮含量（LCH）为87%，从式（1）得锁阳总黄酮含量（TFC）为202.83 mg/g。

图1 芦丁标准曲线

2.2 过氧化氢溶液浓度筛选

如表1所示，过氧化氢浓度与细胞的生长存活率呈现一定的量效关系。当细胞死亡率过大时（≥70%），说明该损伤浓度不具有实验意义，故本实验选取200 μmoL/mL的过氧化氢溶液建立体外氧化损伤模型。

表1 过氧化氢浓度对细胞生长存活率的影响（±s，n=9）

表1 过氧化氢浓度对细胞生长存活率的影响（±s，n=9）

注：与对照组比较，*为P＜0.05（差异显著），**为P＜0.01（差异极显著）。

组别 过氧化氢浓度/（μmoL/mL） 细胞生长存活率/%阴性对照组 100 200 42.88±3.21**400 25.72±2.73**800 14.15±3.02**实验组

2.3 锁阳黄酮样品浓度的筛选

由图2可知，在0～100 μg/mL浓度范围内，锁阳黄酮对过氧化氢诱导的大鼠肝星状细胞损伤有一定的保护作用；当浓度大于100 μg/mL时，细胞存活率急剧减小；25～100 μg/mL的锁阳黄酮对大鼠肝星状细胞的保护作用明显。数据表明，高浓度的锁阳黄酮（＞100 μg/mL）对大鼠肝星状细胞的生长有抑制作用，因此本实验选取浓度为25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的锁阳黄酮进行细胞抗氧化损失实验。

图2 锁阳黄酮对大鼠肝星状细胞的保护作用

2.4 锁阳黄酮对大鼠肝星状细胞氧化损伤的保护作用

2.4.1 锁阳黄酮对大鼠肝星状细胞中蛋白浓度的影响

如表2所示，与对照组相比，模型组大鼠肝星状细胞中的蛋白浓度显著增加（P＜0.01），说明造模成功。而低、中、高剂量的锁阳黄酮溶液使大鼠肝星状细胞中的蛋白浓度分别减少13.59%（P＜0.05）、18.55%（P＜0.01）和26.38%（P＜0.01）。说明锁阳黄酮可以抑制过氧化氢诱导的大鼠肝星状细胞蛋白浓度的增加。

表2 锁阳黄酮对大鼠肝星状细胞氧化损伤的保护作用（±s，n=9）

表2 锁阳黄酮对大鼠肝星状细胞氧化损伤的保护作用（±s，n=9）

注：与模型组比较，*为P＜0.05（差异显著），**为P＜0.01（差异极显著）；与对照组比较，#为P＜0.05（差异显著），##为P＜0.01（差异极显著）。

组别 蛋白浓度/（g/L） MDA/（nmol/mg） NOS/（U/mL）对照组 15.41±1.32 1.32±0.13 9.19±0.82损伤模型组 33.04±2.87## 2.56±0.19## 6.32±0.59#25 μg/mL 锁阳黄酮组 26.62±2.14* 1.83±0.08** 6.07±0.71 50 μg/mL 锁阳黄酮组 26.91±2.84** 1.62±0.07** 7.56±0.73*100 μg/mL 锁阳黄酮组 24.32±3.01** 1.55±0.14** 8.13±0.92*

2.4.2 锁阳黄酮对大鼠肝星状细胞中MDA的影响

如表2所示，当用200 μmol/mL的过氧化氢溶液对大鼠肝星状细胞形成氧化损伤后，大鼠肝星状细胞中的MDA含量增加到2.56 nmol/mg，细胞氧化损伤造模成功。加入低、中、高剂量不同浓度的锁阳黄酮溶液后，大鼠肝星状细胞中的MDA含量分别减少28.52%、36.72%和39.45%（P＜0.01）。说明锁阳黄酮对过氧化氢诱导的大鼠肝星状细胞MDA含量的增加具有拮抗作用。

2.4.3 锁阳黄酮对大鼠肝星状细胞中NOS的影响

如表2所示，与对照组相比，模型组大鼠肝星状细胞中的NOS含量显著降低（P＜0.05），说明造模成功。低剂量的锁阳黄酮溶液对氧化损伤的大鼠肝星状细胞NOS无明显影响（P＞0.05），而中剂量和高剂量的锁阳黄酮溶液使大鼠肝星状细胞中的NOS含量分别增加19.44%（P＜0.05）和28.57%（P＜0.05）。说明中、高浓度锁阳黄酮对过氧化氢诱导的大鼠肝星状细胞NOS表达的降低具有拮抗作用。

过氧化氢是一种重要的活性氧，极易通过细胞膜与细胞内铁离子反应形成高活性OH·损伤细胞。细胞内氧化还原系统失衡，体内的高活性分子产生过多，细胞中出现大量自由基，引起大鼠肝星状细胞结构及功能的改变，加剧肝细胞的损伤程度并导致组织损伤，而肝星状细胞活化是引起肝纤维化的主要原因[9-11]。

黄酮类化合物对大鼠肝星状细胞的氧化损伤有一定的保护作用。实验数据表明，一定浓度范围内（25～100 μg/mL）的锁阳黄酮作用于过氧化氢处理的大鼠肝细胞时，有显著的抗氧化作用。锁阳黄酮通过提高受到抑制的细胞活性，改善细胞生长状态，降低MDA含量，从而减少细胞坏死。当锁阳黄酮浓度超过100 μg/mL时，锁阳黄酮对大鼠肝星状细胞的抑制率增加，表现出毒副作用。

3 结论

综上所述，本研究表明锁阳黄酮对于过氧化氢诱导的大鼠肝星状细胞氧化损伤具有一定的保护作用，它提高了细胞存活率、降低了细胞蛋白浓度和MDA含量、增加了NOS蛋白表达水平。这将为锁阳黄酮作为治疗肝脏纤维化的天然药物开发提供参考依据。