短链脂肪酸对THP-1 细胞和COPD 小鼠炎症反应的影响

张 桐，汪澎涛，康宇婷，杨宁爱，赵志军，贾 伟

（1. 宁夏医科大学临床医学院，宁夏银川 750004；2. 宁夏医科大学总医院宁夏病原微生物重点实验室，宁夏银川 750004）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种以慢性气道炎症、持续呼吸道症状和慢性气流受限为特征的慢性肺部疾病[1-2]。据统计，全球人口有4%～5%（3.28 亿）人患有COPD[3]。慢性炎症在COPD的发病机制中处于核心地位。在一项109例COPD 患者的横断面研究中，患者血浆炎症因子含量升高，其中白介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白介素6（interleukin-6, IL-6）最能反映个体的严重情况[4]。一项动物研究中，给COPD 小鼠喂食高纤维饮食小鼠的粪便后，其肺泡灌洗液和血浆中的炎症因子干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、IL-6 水平降低[5]。目前治疗COPD 的抗炎药物主要是糖皮质激素，但长期使用会导致代谢紊乱、感染等不良反应，因此寻找新的靶向抗炎药物对于COPD 患者的治疗显得尤为重要。短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）作为一种肠道菌群发酵膳食纤维形成的内源性产物，包括乙酸（acetate）、丙酸（propionate）、丁酸（buty rate），可以起到保护肠道稳态、调节肠道pH 的作用[6]，越来越引起研究者的重视。研究发现，喂养高纤维饮食的小鼠可以增加SCFAs 循环水平，并防止肺部过敏性炎症，而低纤维饮食则降低SCFAs 的循环水平，加重小鼠的肺部过敏性炎症[5]，但SCFAs 在COPD 中的作用机制仍然不甚清楚。本研究拟通过SCFAs 干预脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的人单核细胞白血病（THP）细胞和COPD 小鼠模型，通过检测炎性相关因子表达情况，探讨SCFAs 在THP-1 细胞和COPD 小鼠中的抗炎作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

本研究中的10 名正常人和10 名COPD 患者均来自宁夏医科大学总医院呼吸内科，所有诊断均符合中华医学会呼吸病学分会修订的《慢性阻塞性肺疾病防治指南（2013年修订版）》，排除合并有其他肺部疾病及感染者，以及其他系统疾病如心、肝、脑、肾等严重功能障碍者。COPD 小鼠模型购买自武汉云克隆公司，LPS（L4391）、乙酸钠（S2889，NaA）、丙酸钠（P1880,NaP）、丁酸钠（B5887,NaB）购自美国Sigma-Aldrich，胎牛 血 清（16140043）购 自 美 国GIBCO 公 司，iNOS（39898）、NF-κB（3039）抗体购自美国CST 公司，TB Green premix Ex TaqⅡ（RR420Q）购自日本TaKaRa公司。

1.2 细胞培养及分组

THP-1 细胞购买于武汉普诺赛生命科技有限公司，在含有100 mL/L 胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1 mmol/L 丙酮酸、1% 青霉素和链霉素的RPMI 1640 培养基中，37℃、50 mL/L 二氧化碳培养箱中培养。进行实验前，将细胞接种在12 孔板上，并用20 ng/mL 佛波酯（PMA）处理48 h 诱导成巨噬样细胞，实验中所有细胞类型均为巨噬样THP-1 细胞系。根据LPS 刺激不同时间以及不同的SCFAs干预，将细胞分为9 组：对照组(Control)、脂多糖刺激细胞6 h组(LPS 6 h 组)、LPS 6 h+乙酸钠组(NaA 6 h 组)、LPS 6 h+丙酸钠组(NaP 6 h 组)、LPS 6 h+丁酸钠组(NaB 6 h 组)、脂多糖刺激细胞12 h 组(LPS 12 h 组)、LPS 12 h+乙酸钠组(NaA 12 h 组)、LPS 12 h+丙酸钠组(NaP 12 h 组)、LPS 12 h+丁酸钠组（NaB 12 h 组）。细胞实验均进行3 次生物学重复。

1.3 COPD 小鼠模型的构建

SPF 级Balb/c 小鼠购自武汉云克隆公司。主要试剂包括红金龙香烟（湖北中烟工业有限责任公司生产，烤烟型，每支含焦油量9 mg）、LPS（美国Sigma 公司）。建模方式：SPF 级Blab/c 小鼠，适应性饲养1 周，采用鼻腔滴入LPS加熏香烟的方法建立COPD 小鼠模型。分别于第1、29 天经鼻腔滴入LPS（30 μg/6 μL），第2～30 天（除第29 天）将小鼠放入自制玻璃熏箱，10 支/次，30 min/次，5 d/周，共4 周。

1.4 动物分组及饲养条件

将小鼠分为3 组：野生型组（WT 组）、慢性阻塞性肺疾病组（COPD 组）、慢性阻塞性肺疾病+丁酸钠组（COPD+NaB 组）。每组8 只，分笼饲养共21 d，温度（24±2）℃，自由进食饮水。

1.5 qRT-PCR 检测外周血细胞、THP-1 细胞和小鼠肺组织炎症因子表达

Trizol法提取细胞和组织的总RNA，用TaKaRa 反转录试剂盒合成cDNA，qRT-PCR测定细胞样品及组织样品中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达。以GAPDH作为内参，引物为上海生工合成,所用引物见表1。

表1 本研究中用到的引物序列Tab. 1 Primer sequences used in this study

1.6 ELISA 检测外周血血浆、THP-1 细胞上清液和小鼠血浆中炎症因子浓度

用300 μL 的洗液浸泡酶标板30 s，标准孔加入100 μL 的2 倍稀释的标准品，空白孔加入100 μL 样本稀释液；加入样本（90 μL 缓冲液和10 μL 血浆，100 μL细胞培养上清液）；加入抗体50 μL，封板膜封板，300 r/min 震荡，室温孵育1.5 h；加入300 μL 洗涤液洗涤6 次，之后每孔加入100 μL 辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素；300 r/min 震荡，室温孵育30 min，洗涤6 次；每孔加入100 μL TMB 避光孵育20 min；每孔加入100 μL 终止液，测定在450 nm 的吸光度值。

1.7 小鼠肺组织病理染色

肺组织用40 g/L 多聚甲醛固定24 h，包埋后切片，切片厚度4 μm。HE 染色：依次放入Histo-clearⅠ5 min、Histo-clearⅡ5 min、无水乙醇2 min、950 mL/L乙 醇2 min、900 mL/L 乙 醇2 min、800 mL/L 乙 醇2 min、700 mL/L 乙醇2 min 脱蜡至水。苏木素染核5 min，盐酸乙醇分化数秒，水洗3 min。伊红染细胞质5 min，脱水封片。天狼星染色：切片脱蜡至水后，加入天狼星红染液，滴染1 h，冲洗10 min，苏木素染色10 min。

1.8 Western blotting 检测THP-1 细胞和小鼠肺组织炎症因子表达

细胞：每孔加入500 μL 裂解液（含5 μL 磷酸酶抑制剂、0.5 μL 蛋白酶抑制剂、2.5 μL PMSF）冰上裂解30 min，12 000 r/min 离心10 min，收集上清液；动物组织：将组织剪碎洗净后，每孔加入500 μL 裂解液（含5 μL 磷酸酶抑制剂、0.5 μL 蛋白酶抑制剂、5 μL PMSF）匀浆90 s，冰上裂解30 min，12 000 r/min 离心10 min，收集上清液得到蛋白悬液。BCA 法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度调整上样量。100 V 恒压电泳120 min，300 mA恒流90 min转印至PVDF膜。100 g/L脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗（1∶2 000稀释），4 ℃孵育过夜。次日用TBST 洗涤3 次，每次10 min。加入二抗，室温孵育1 h，TBST 洗涤3次，用ECL曝光液显色。

1.9 统计学分析

利用Graphpad Prism 8 统计软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，组间两两比较采用Tukey test for multiple comparisons 检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 COPD 患者外周血炎症因子的变化

临床基本特征统计分析显示，COPD 患者1 s 内用力呼气量（FEV1%）和1 s 内用力呼气量/用力肺活量比率（FEV1/FVC）均低于正常人，具有统计学差异（P＜0.000 1，P＜0.000 1），如表2 和图1 所示。收集正常人和COPD 患者的外周血，qRT-PCR 检测两组人群IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 表达量，ELISA 检测炎症因子的浓度，结果如图2 所示。与正常人相比，COPD 患者外周血炎症相关因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达均明显升高（P＜0.000 1，P＜0.000 1，P＜0.001），其浓度也均明显升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），表明COPD 患者存在全身性慢性炎症。

图2 COPD 患者和正常人外周血炎症因子表达Fig. 2 Expressions of inflammatory factors in peripheral blood of COPD and normal people

表2 COPD 患者与正常人基本特征Tab. 2 Basic characteristics of COPD patients and normal people

****P＜0.000 1。

2.2 短链脂肪酸对LPS 诱导的THP-1 炎症反应的影响

为了探究SCFAs 对LPS 诱导THP-1 细胞炎症的影响，本研究分别用2 mmol/L NaA、NaP、NaB 提前孵育细胞12 h，然后加入100 ng/mL LPS 刺激6 h和12 h，通过qRT-PCR 和ELISA 检测各组的炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6 的mRNA 相对表达水平和浓度，实验结果如图3 所示。与Control 相比，LPS 刺激THP-1 细胞后各炎症因子mRNA 表达量均升高，在SCFAs干预后，发现NaP 和NaB 能明显降低炎症因子的表达。其中NaB 6 h、NaB 12 h 组均能降低TNF-α（P＜0.05，P＜0.05）和IL-6（P＜0.001，P＜0.01）的mRNA 表达量。NaP 6 h、NaP 12 h 组IL-6 mRNA 表达量降低（P＜0.05，P＜0.05），而NaA 对这3 种炎症因子mRNA 表达无影响。ELISA 结果与qRT-PCR结果基本一致，这3 种炎症因子含量在LPS 刺激后均升高，TNF-α 和IL-6 含量在NaB 6 h、NaB 12 h 组均降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.001）。IL-6含量在NaP 12 h 组降低(P＜0.05)，而NaA 6 h 和12 h组的IL-1β 浓度升高（P＜0.05，P＜0.05），说明NaA对THP-1 细胞具有一定的促炎功能。其中以NaB降低LPS 诱导的THP-1 炎症反应最明显。

A：qRT-PCR 检测细胞炎症因子mRNA 表达；B：ELISA 检测细胞上清炎症因子含量。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。

2.3 构建COPD 模型小鼠

为了进一步探究SCFAs 体内的抗炎作用，本研究使用COPD 小鼠模型进行后续研究。通过鼻腔滴入LPS 加熏香烟的方法建立的COPD 小鼠，HE 染色显示WT 组肺组织支气管壁光滑，COPD 组支气管狭窄（图4A、图4B）。图4D 中箭头所示肺泡壁断裂，肺大疱形成。天狼星染色如图4E、图4F 所示，图4F 中箭头所示COPD 组支气管周围出现大量粉红色纤维化组织。与WT 组相比，COPD 组肺泡破坏增加，用两条随机通过图片的线段长度除以线段经过的肺泡隔数计算平均内衬间隔（MLI），COPD 组平均肺泡间隔明显增加（P＜0.001，图4G）。

A、B：HE 染色（肺部气管）；C、D：HE 染色（肺部肺泡）；E、F：天狼星染色（肺部气管）；G：MLI 统计结果。***P＜0.001

2.4 丁酸盐对小鼠炎症相关因子的影响

体外实验表明，NaB 能很好地抑制THP-1细胞的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达，因此本研究继续探究NaB 在小鼠体内的抗炎作用。在COPD小鼠的饮用水中加入浓度为60 mmol/L的NaB，取小鼠外周血血浆，通过ELISA 法检测各组的IL-1β、IL-6、TNF-α浓度，结果如图5A 所示：与WT 组相比，COPD 组小鼠血浆炎症因子浓度升高，NaB 能降低COPD 小鼠血浆中IL-1β、IL-6 的浓度（P＜0.05，P＜0.05），但不影响TNF-α 的表达。各组小鼠肺组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表达结果如图5B 所示：COPD组小鼠肺组织中高表达的炎症因子在COPD+NaB组均降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05）。研究结果表明，NaB 不仅能降低小鼠肺组织的炎症反应,还能对小鼠循环外周血的炎症反应起到很好的抑制作用。

图5 丁酸盐对小鼠炎症相关因子的影响Fig.5 Effects of butyrate on inflammation-related factors in mice

2.5 丁酸盐对小鼠肺组织炎症蛋白表达的影响

核转录因子Kappa B（NF-κB）的活化是COPD 发病的重要炎症通路之一，NF-κB 调控TNF-α、IL-6、IL-8 等炎症因子产生，NF-κB 蛋白的磷酸化水平升高是该通路活化的重要标志。因此，本研究检测小鼠肺组织中NF-κB 和P-NF-κB 的蛋白表达水平。取小鼠肺组织，匀浆后提取蛋白，用Western blotting 检测P-NF-κB、NF-κB，实验结果如图6所示。与WT 组相比，COPD 组P-NF-κB 表达量升高，COPD+NaB组P-NF-κB 表达量降低，表明NaB 能抑制COPD 小鼠肺组织NF-κB 通路的激活。

图6 丁酸盐对小鼠肺组织NF-κB 蛋白表达的影响Fig. 6 Effects of butyrate on the expression of NF-κB protein in the mice’s lung tissue

3 讨 论

SCFAS 由未消化吸收的碳水化合物在结肠被厌氧菌发酵而成，为1～6 个碳原子的有机脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸。SCFAS 在肠道中处于高浓度，并且很容易被吸收到血流中，通过循环系统影响外周组织的免疫和炎症反应[5]。在炎症部位，SCFAs 可以通过减少炎症因子和趋化因子的释放，增强细胞吞噬能力，激活T 细胞生成等方式发挥抗炎作用，通过肠-肺轴对哮喘、肺炎、COPD 等多种肺部疾病产生影响，但其中的机制还有待进一步研究[7]。

慢性炎症一直被认为是COPD 发病的重要原因之一[8]。在慢性炎症中，肺的不同部位有巨噬细胞、T 淋巴细胞和中性粒细胞的增加和炎症因子的产生。其中巨噬细胞过度活化导致功能紊乱，释放高水平的炎症因子和趋化因子促进COPD 疾病进展，因此，抑制巨噬细胞炎症因子的表达、调节相关信号通路的活性是治疗COPD 慢性炎症的有效方法[9]。

THP-1 细胞具有人原代单核细胞相似的形态和功能，常被用于免疫和炎症的研究，同时THP-1 细胞被作为COPD 的全身细胞模型，用于LPS 刺激的病原体相关分子模式（PAMP）研究[10]。在本研究中，COPD 患者外周血炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 高表达会诱发炎症反应，LPS 会诱导THP-1 细胞产生这3 种细胞因子，3 种SCFAs 干预后对这些炎症因子表达产生了不同的影响。研究结果表明，NaB 同时降低了IL-6、TNF-α 的mRNA 表达和上清浓度，这与CHEN 等[11]发现的NaB 调节LPS 诱导的小鼠单核巨噬细胞（RAW246.7）炎症反应的研究结果一致。NaP 降 低 了THP-1 细 胞IL-6 mRNA 表 达，IL-6 能介导炎症反应，促进T 细胞和B 细胞的增生和分化，参与免疫调节，影响代谢等[12]，表明NaP 在THP-1 细胞系中有一定的抗炎作用。而NaA 促进IL-1β 的表达，提示NaA 可能对THP-1 细胞炎症反应起到促进作 用，SCFAs 中，NaB 在THP-1 细 胞 中 的 抗 炎 作 用效果最为显著。

SCFAs 通过结合GPCR 受体（GPR41、GPR43、GPR109a）调控下游的炎症基因，但3 种SCFAS 对相同受体亲和力并不相同，其中GPR41 对乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐具有相似的亲和力，而GPR43 对丙酸盐的亲和力大于丁酸盐，而对乙酸盐的亲和力低，只有丁酸盐以低亲和力与GPR109A 结合[13]。3 种SCFAs与GPCR 受体不同的结合程度可能是造成它们对THP-1 细胞炎症反应产生不同影响的原因。

为了进一步探究NaB 在COPD 小鼠体内的抗炎作用，本研究用60 mmol/L 的NaB 对COPD 小鼠进行喂养，发现NaB 降低了COPD 小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 表达和血浆中IL-1β、IL-6 含量，说明NaB 对COPD 小鼠全身和肺部的慢性炎症均有一定程度的抑制作用。在COPD 病程中，NF-κB 能够诱导多种炎性因子表达，如IL-6、IL-8、趋化因子、TNF-α 等，参与了气道慢性炎症反应的众多环节，并在一定程度上促进了炎症的发生发展。Western blotting 结 果 显 示，NaB 降 低 了 肺 组 织NF-κB 磷 酸 化 水平，提示NaB 可能通过抑制NF-κB 通路来降低炎症因子表达，从而发挥抗炎作用。该分子机制还需要在肺泡巨噬细胞上进一步验证，NaB 如何调节NF-κB 蛋白表达也还需要进一步探讨。

综上所述，SCFAS 之一的丁酸盐能显著降低THP-1 细胞和COPD 小鼠中的炎症反应，可能的分子机制是通过抑制NF-κB 信号通路降低炎症因子的表达，作为COPD 的抗炎候选药物，丁酸盐有望能成为治疗COPD 慢性炎症的新选择。