基于网络药理学和分子对接方法研究右归丸治疗膝骨关节炎的作用机制

刘小沛，谭从娥，沈 霞，王相东，邢文文

（陕西中医药大学基础医学院，陕西咸阳 712046）

膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)是以膝关节软骨破坏为特性的退行性骨关节病，表现为膝关节的慢性炎症伴骨赘形成等病理变化，常以膝痛、关节活动障碍为主症，治疗不当则导致关节畸形或残疾，长期的活动不便及膝关节疼痛严重降低了患者的生活质量，并给他们带来了巨大的心理负担[1]。调查显示，我国65 岁以上人群中KOA 的发病率达80%，给家庭和社会带来了沉重的经济负担[2]。目前非甾体抗炎类和皮质类固醇类药物是KOA 的主要治疗药物[3]，但此类药物仅能缓解症状，并不能有效阻止病情进展，且不良反应较大[4]。中医药治疗KOA 具有疗效持久、不良反应小等优势，临床可根据辨证分型选择方药。右归丸出自《景岳全书·新方八阵》，全方由熟地黄、附子、肉桂、山药、山茱萸、菟丝子、鹿角胶、枸杞子、当归、杜仲组成，具有温补肾阳、填精补血作用。研究证实，采用非甾体抗炎药美洛昔康联合右归丸治疗KOA，其疗效优于单独使用非甾体抗炎药，且能增强膝骨关节软骨细胞保护作用，并能促进成骨细胞增殖、调节骨代谢水平[5-7]。右归丸已被广泛应用于KOA 的临床治疗，但其具体作用机制仍不明确。因此，本研究借助网络药理学及分子对接技术探究右归丸治疗KOA 的作用机制，以期为右归丸的临床应用和新药研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 右归丸活性成分查询

利用计算机系统生物学实验室TCMSP 数据库(https://tcmsp-e.com/)检索右归丸中植物药的化合物，以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18 为条件筛选右归丸的活性成分，并通过文献检索对虽不满足上述条件，但却有明显药效作用或中药含量较多的活性成分予以补充。因方中动物药鹿角胶的主要成分为蛋白质和氨基酸等[8]，故不纳入分析。

1.2 右归丸活性成分靶点预测

将1.1 项筛选出的活性成分导入TCMSP，Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)、Target Net (http://targetnet.scbdd.com/home/index/)网站进行活性成分靶点预测，为提高结果的可信度，Swiss Target Prediction 网站选择结果的前15 个[9]，TargetNet 网 站 选 择Prob≥0.9[10]的 结 果。将预测的活性成分靶点导入UniProtKB 数据库(https://www.uniprot.org/)矫正为标准基因名。

1.3 KOA 相关靶点搜集

通过检索中医药整合药理学研究平台（TCMIP）

(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)，CTD(http://ctdbase.org/)，DisGeNET（https://www.disgenet.org/）等数据库，关键词为“Knee osteoarthritis(KOA)”，为提高结果的可信度，CTD 数据库选择带有“M(marker/mechanism)”或“T(therapeutic)”标记的靶点[11]，DisGeNET 数 据 库 选 择Score_gda≥0.01 的 结果[12]，GeneCards 选 择Relevance score≥5 的 结 果。将每个数据库获取的靶点汇总并去重，最终筛选出KOA相关靶点。将1.2项获取的右归丸活性成分靶点与KOA相关靶点取交集，作为右归丸治疗KOA的潜在靶点。

1.4 FDA 批准的抗KOA 药物和靶点

通过Drug Bank数据库(https://go.drugbank.com/)获取美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗KOA 的药物和靶点，并将数据导入Cytoscape 构建药物靶点网络。

1.5 蛋白互作网络的构建

利用STRING 数据库(https://www. string-db.org/)构建蛋白相互作用网络(protein-protein interaction network，PPI)，在“multiple proteins”栏目输入右归丸治疗KOA 的潜在靶点，物种设定为“Homo sapiens”，置信度选择“high confidence(0.700)”，获取右归丸疗效相关PPI 网络，并将此网络导入Cytoscape 进行可视化，采用插件CytoHubba计算网络中节点的拓扑参数。

1.6 功能富集分析

利用R Studio 进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，选用R 包“clusterProfiler”[13]，设 定“P-value”＜0.01，并 通 过“ggplot2”包对显著富集结果进行作图。

1.7 中药-活性成分-关键靶点-显著通路-生物过程网络的构建

根据1.5项的分析结合1.1项和1.2项的搜集结果，构建中药-活性成分-关键靶点-显著通路-生物过程网络，并定位出右归丸治疗KOA的核心网络作用分子功能模块。

1.8 分子对接

将关键靶点及其对应的化合物进行分子对接实验，验证其相互作用活性，对接软件选择AutoDock Vina。蛋白质晶体结构从RCSB PDB 数据库(https://www1.rcsb.org/)下载，化合物从TCMSP 数据库下载。利用AutoDock Tools 对蛋白质晶体和化合物结构进行处理，包括分离蛋白质结构和原始配体、去除水分子、为结构加电荷，转换成“PDBQT 格式，利用Vina软件完成分子对接，提取对接结果，并对结合能力较强的结合模式作图。

2 结 果

2.1 右归丸活性成分的查询结果

共获取右归丸活性化合物158 个，其中当归2 个、杜仲33 个、附子21 个、枸杞45 个、肉桂8 个、山药16 个、山茱萸20 个、熟地黄2 个、菟丝子11 个，结果见表1(每味中药仅列出OB 排名前5 的化合物)。

表1 右归丸中药活性成分表Tab.1 Detailed information of compounds in Yougui Pills

2.2 右归丸活性成分靶点预测及KOA 相关靶点搜集结果

共获得右归丸活性成分靶点490 个，KOA 相关靶点512 个。将右归丸活性成分靶点与KOA 相关靶点取交集，作为右归丸治疗KOA 的潜在作用靶点，共76 个(图1)。

图1 右归丸活性成分靶点-疾病靶点韦恩图Fig.1 Yougui Pills’active component target-disease target Venn diagram

2.3 FDA 批准的抗KOA 药物及其分子靶点

共获取6 个FDA 批准的治疗KOA 的小分子药物，对应了34 个已经验证的分子靶点，其中13 靶点为右归丸和FDA 批准药物的共有靶点（图2）；采用Cytoscape 将FDA 批准的KOA 治疗药物与其对应的靶点之间的作用关系构建药物-靶点网络图（图3）。

图2 右归丸活性成分靶点与FDA 批准药物靶点韦恩图Fig. 2 Venn diagram of the target components of Yougui Pills and the drug targets approved by the FDA

图3 FDA 批准药物-靶点网络Fig.3 FDA Approved Drug-Target Network

2.4 蛋白互作网络的构建

潜在治疗靶点的蛋白互作网络图见图4。图中74 个靶点存在465 条相互作用。我们通过参数度中心性(degree centrality, DC)、紧密中心性(closeness centrality, CC)和中介中心性(betweenness centrality,BC) 3 个参数分别筛选出网络中的重要节点13、37、74 个，其中IL6、VEGFA、IL1B 等18 节点的DC、CC和BC 超过整个网络拓扑参数的平均值，说明这18 个靶点可能是右归丸治疗KOA 的关键靶点（表2）。

表2 关键靶点拓扑参数Tab.2 Topological parameters of key targets

图4 潜在治疗靶点的蛋白互作网络Fig.4 Protein interaction network of potential therapeutic targets

2.5 功能富集分析

2.5.1 GO 富集分析结果 共得到右归丸潜在治疗靶点的GO 条目1 358 条，其中生物学过程（biological process, BP）1 281 条、分子功能（molecular function,MF）60 条以及细胞组分（cellular component, CC）17 条，显著富集结果如图5所示。潜在治疗靶点涉及的BP 主要为炎症反应调节（regulation of inflammatory response）、活性氧代谢过程调控（regulation of reactive oxygen species metabolic process）、活性氧代谢过程（reactive oxygen species metabolic process）等。

图5 GO 富集结果Fig.5 GO enrichment results

2.5.2 KEGG 富集分析结果 共得到右归丸潜在治疗靶点显著富集的KEGG 通路50 条，其中白细胞介素-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）和肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）位居前两位（图6）。50条显著富集的通路所涉及的生物过程主要包括免疫系统（immune system）、信号传导（signal transduction）、内分泌系统（endocrine system）等（图7）。选择具有统计学差异的前20 条通路的分子靶点，构建关键靶点-显著通路网络，并用软件Cytoscape 进行可视化，通过插件ClusterMaker 的community cluster（Glay）算法对网络进行模块化，发现有5 个生物模块与右归丸治疗KOA 的作用相关（图8）。

图7 KEGG 通路涉及到的生物过程Fig.7 Biological processes involved in the KEGG pathway

图8 关键靶点-显著通路的模块分析Fig.8 Key target-significant pathway module analysis

2.6 中药-活性成分-关键靶点-显著通路-BP 网络

右归丸作用相关中药-活性成分-关键靶点-显著通路-生物过程网络见图9。右归丸可通过多个化合物作用于多个靶点和通路调节不同的生物过程而发挥对KOA 的治疗作用。

图9 中药-活性成分-关键靶点-显著通路-生物过程网络Fig.9 Traditional Chinese medicine-active components-key targets-significant pathways-biological process network

2.7 分子对接结果

关键蛋白质与其对应的化合物的对接结果见表3。分子对接结果的平均结合能为-7.23 kcal/mol，低于-5 kcal/mol 表明靶点蛋白和化合物具有较强的结合能力[14]。对结合活性较强的结果进行对接模式分析（图10）显示，右归丸活性成分均深入活性位点，并与活性位点关键氨基酸残基形成极性或非极性键，以稳定配体和受体的结合。右归丸相互作用力分析结果显示，右归丸的活性成分主要通过氢键、疏水作用、pi相互作用及范德华力与关键靶点的活性位点相结合。

图10 关键靶点和活性成分结合模式分析Fig.10 Analysis of binding modes of key targets and active ingredients

表3 分子对接结果Tab. 3 Results of molecular docking

3 讨 论

右归丸为温补肾阳的经典方剂，具有促进软骨细胞增殖、修复受损软骨、延缓骨关节炎进程的作用[15]，对KOA 有较好的治疗效果[16]。本研究运用网络药理学方法，对右归丸治疗KOA 的活性成分、作用靶点、分子通路及其生物学过程进行研究，通过TCMSP 数据库分析及文献补充，共筛选出右归丸中植物药活性成分158 种，对应490 个靶点，其中76 个靶点有潜在治疗作用。

借助DrugBnak 数据库，搜集了FDA 批准的治疗KOA 的西药及其靶点，得到6 个西药所对应的34 个靶点，其中右归丸与药物双醋瑞因（diacerein）、度洛西汀（duloxetine）、氨基葡萄糖（glucosamine）的所有靶点一致，与双氯芬酸（diclofenac）、透明质酸（hyaluronic acid）的作用靶点部分一致，提示右归丸可能和这些药物具有相同或类似的药理作用。PPI 结果显示，治疗KOA 关键靶点有18 个，其中IL-1β、TNF-α、IL-6 为促炎细胞因子，在KOA 的发生发展中起着重要作用[17]。研究显示，关节液中IL-1β、IL-6 及TNF-α水平与KOA 病变程度呈正相关[17-20]，其中IL-6 在疾病发展过程中能够激活JAK/STAT 途径，引起炎症反应和软骨破坏，可间接反应关节的损伤程度[21]；IL-1β和TNF-α 可导致软骨细胞外基质降解，抑制软骨细胞代谢，诱导其凋亡。有报道称，右归丸能抑制IL-1、IL-6 及TNF-α 的表达，降低其血清水平，减轻炎症反应[22-24]，这与本研究的结果是一致的。MMP9 是基质蛋白酶家族（MMPs）的组成部分，能降解大部分关节软骨基质，在KOA 的发生发展中起着重要作用[23]。本研究也发现，右归丸对MMP9、MMP8、MMP13 等均有调控作用，提示右归丸可能通过抑制KOA 关节软骨中MMPs 的表达来发挥抑制炎症及修复受损关节的作用[24-26]。研究显示，由VEGFA 介导的软骨内血管生成而造成的软骨缺损、炎症以及骨赘形成是KOA 的重要发病机制之一[27]。TP53 与细胞周期的阻滞、凋亡、衰老、DNA 修复或代谢改变相关[28]。

右归丸疗效相关靶点的GO 分析结果显示，炎症反应、氧化应激、活性氧代谢等生物学过程显著富集，提示右归丸对KOA 的治疗作用可能与抑制局部炎症反应及改善机体代谢水平相关。通过KEGG 富集分析，共筛选出50 条显著富集的分子通路，其中最具显著性的是IL-17 信号通路和TNF 信号通路。研究显示，IL-17 的异常表达与OA 的发病及疼痛程度密切相关，阻断IL-17 信号传导途径可能会缓解KOA 相关的疼痛[29]。本研究发现，IL-17 信号通路在右归丸治疗后显著富集，提示该分子通路可能是右归丸缓解KOA 疼痛的主要分子途径。TNF 属于促炎细胞因子，可激活IL-1β、IL-6 和TNF-α 等 炎症细胞因子，还可激活MMP3、MMP9、MMP13 等MMP 类基因，调节关节局部炎症反应及软骨组织重塑。本研究发现，TNF 信号通路显著表达，提示右归丸不仅可以调控炎症反应，还可抑制关节软骨的降解而发挥对KOA 的治疗作用。

右归丸治疗KOA 的活性成分-靶点-通路网络模块显示，有5个关键生物模块与右归丸调控效应关系最为密切，其中模块1 包括IL-17 信号通路、TNF 信号通路、Toll样受体信号通路等炎症反应通路，模块2 包括PI3K-Akt信号通路、HIF-1 信号通路等自噬与凋亡相关通路，模块3 为破骨细胞分化通路，模块4 为MMPs相关通路，模块5 包括MAPK 信号通路、p53 信号通路和Sphingolipid 信号通路，提示右归丸对KOA 的调节作用具有广泛性和多系统性，其作用机制与炎症反应抑制、细胞自噬和凋亡调控环节更为密切，说明右归丸可以通过调节一系列炎症分子的相互作用，并诱导KOA 滑膜细胞自噬，减少关节软骨细胞的凋亡，从而起到缓解关节内炎性浸润和软骨破坏的作用。

分子对接结果显示，槲皮素（Quercetin)(MOL ID:MOL000098；来源：杜仲、枸杞、肉桂、菟丝子)、Doradexanthin（MOL ID：MOL005461；来源：山药）、苦参碱（Matrine）(MOL ID：MOL005944；来源：菟丝子)、去氢双丁香酚(Dehydrodieugenol) (MOL ID:MOL009030；来源:杜仲)等与关键靶点IL-1β、IL-6、TNF-α 和MMP9 具有较强的结合活性，说明这些化合物可能是右归丸发挥药效的关键组分。研究显示，槲皮素能够通过减弱氧化应激反应和抑制软骨细胞外基质的降解来减缓KOA 的发展[30]；苦参碱能够通过下调吞噬细胞、淋巴细胞和受损组织细胞的炎性细胞因子，如IL-6 及其受体、TNF、趋化因子、炎性蛋白-3 等的表达产生抗炎作用[31]。本研究发现，右归丸关键组分与IL-1β、IL-6、TNF 等炎症因子对接具有较强的结合力，提示槲皮素、苦参碱等是右归丸抑制KOA 慢性炎症的主要化合物。目前针对化合物皮黄素(Doradexanthin)的研究较少，可以作为未来的研究方向。

综上所述，化合物槲皮素、苦参碱、皮黄素和去氢双丁香酚为右归丸治疗KOA 的关键化合物，这些化合物可通过IL-17 信号通路、TNF 信号通路等炎症信号通路，调控IL-1、TNF-α 和IL-6 等促炎细胞因子和MMP9、MMP8、MMP13 等基质蛋白酶家族基因的表达，而发挥抑制KOA 患者关节局部的炎症反应、减弱氧化应激、调节软骨细胞的增殖和凋亡等作用。本研究对右归丸治疗KOA 的作用机制有一定的借鉴作用，但所得结果还需进一步实验验证。