实时荧光定量PCR技术在本科实验教学中的应用探讨

张贺翠，冯 萍，李帮秀，薛雨飞，杨 昆，朱利泉

（西南大学农学与生物科技学院，重庆 400715）

分子生物学是生物学的前沿与生长点，是指从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学，它同时是一门理论与实践相结合的综合性的新兴学科[1]。分子生物学主要的研究领域是蛋白质体系、蛋白质-核酸体系（中心是分子遗传学)和蛋白质-脂质体系（即生物膜），它目前是农林院校生物专业和涉农专业的重要课程，分子生物学实验技术已成为生命科学领域普遍运用的方法和手段，实验课是一门让学生理解、掌握分子生物学技术的课程[2]。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种根据生物体内DNA 半保留式复制的特点而设计的在体外对特定的DNA 序列放大扩增的新技术。PCR 反应最大的特点是将微量的DNA 进行快速大幅度的扩增，例如化石中的古生物，或者脱落许久的毛发甚至皮肤中只要有一点点DNA都可以通过PCR技术加以扩增和放大，因此目前在分子生物学及其相关学科中得到广泛的应用[3]。

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技术是在普通的聚合酶链式反应基础上发展起来的一种高度灵敏的核算检测技术[4]。qRT-PCR的基本原理是在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[5]。由于qRT-PCR技术较常规PCR 技术相比，具有污染少、定量准确、实时监测、自动化程度高等优点，qRT-PCR 技术在目前的科学研究中大量使用，经常在转基因检测、作物育种、环境科学及医学等领域中使用[6]。例如新冠肺炎病毒的核酸检测，通过qRT-PCR技术检测荧光信号累积确定是否有新型冠状病毒，如果是带有病毒的患者会检测出荧光信号增强，这样就可以显示阳性的结果。如果是核酸检测没有病毒的患者样本，因为没有靶基因的扩增，就检测不到荧光信号增强，这样的结果就属于新冠肺炎核酸检测阴性[7]。NCBI 中可以搜索到的使用qRT-PCR 做基因表达分析的文章至少20 万篇，中国知网上收集的基因表达的文章至少2 万篇。例如西南大学农学与生物科技学院年均发表80 余篇与此相关的文章，其中水稻、油菜等科研团队在应用实时荧光定量PCR 技术方面取得了一系列重大成果，其相关研究成果在Plant Cell、PNAS、Nucleic Acids Research等国际学术刊物发表。

但是由于购买荧光定量PCR 仪成本高，维护费用高，每个学生的使用成本在30元左右，限制了其在本科生教学中的使用，但是近年来，如何在本科生的实验教学中让学生掌握以后的科研工作中常用的基本实验技术，培养本科生的综合能力和科研素养，促进教学与科研的相互融合已经成为实验教学改革的重要方向[8]。因此，我们在本科生的教学工作中初步进行了不同氮肥施用量下团棵期烟叶叶片中NtCIPK8的定量表达，并取得了较好的数据，让本科生了解到环境因素也会影响基因的表达，由于进行的qRT-PCR 实验涉及到引物的设计、内参基因的选择、RNA 样本制备及纯化、反转录cDNA、相对定量法中内参基因的校准和样品基因的定量检测，掌握到这些基本的实验技术。

1 材料与方法

1.1 教学安排

1）实时荧光定量PCR 实验操作及结果分析共计6个学时；2）实验分组：每2个学生一组；3）学生提前预习荧光定量PCR 的原理、实验方法、操作步骤及注意事项；4）实验结束后，课堂上进行实验结果的分析和讨论，学生提交实验报告。

1.2 实验材料

材料：培养箱培养烟草植株到五叶一心期进行移栽，设置纯氮使用量75.0 kg·hm-2（T1）、90.0 kg·hm-2（T2）、105.0 kg·hm-2（CK） 112.5 kg·hm-2（T3）、120.0 kg·hm-2（T4）、135.0 kg·hm-2（T5）、150.0 kg·hm-2（T6）、165.0 kg·hm-2的8 个处理，其他施肥参照常规施肥方案进行施肥，移栽后植株长到团棵期取叶片，液氮中冻存后放到-80 ℃冰箱保存。

1.3 实验仪器

荧光定量PCR 仪定为BIO-Rad CFX Connect Real-Time PCR System，凝胶电泳装置，微量核酸测定仪。

1.4 实验方法

使用RNA 植物提取试剂盒（天根）从8 个处理的叶片中提取RNA，并纯化，利用高质量的反转录试剂盒将纯化后的RNA 进行反转录，以β-Actin 为内参基因扩增NtCIPK8基因的表达量（见表1）。样本每个处理重复3 次，反应体系为20 μL：2 μL cDNA，上、下游引物各0.6 μL，SYBR10.4 μL，ddH2O 补齐20 μL，反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，57 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，40 个循环，重复3 次。反应结束后分析荧光值变化曲线及熔解曲线。基因的相对表达量采用2-ΔΔCT计算[9]。

表1 NtCIPK8和β-Actin的引物序列

2 结果与分析

2.1 不同氮肥施用量的烟叶团棵期叶片总RNA的提取

以8 个处理的烟叶叶片为材料，参照植物总RNA提取试剂盒说明书提取烟叶叶片重的总RNA，通过超微量分光光度计检测其OD 值和浓度，发现本实验中所提取的叶片中RNA 纯度（OD260/280）值均在1.8～2.1，表明RNA 纯度较高，可以用于后续的反转录和扩增实验。

将提取的RNA 经1.2%（W/V）琼脂糖凝胶电泳分离，如图1 所示，各RNA 条带明亮而没有降解，28S 和18S 条带在亮度上接近2∶1，5S 条带较暗，表明RNA 的纯度和完整性较好，能够用于后续实验分析。

图1 不同氮肥施用量的烟叶团棵期叶片总RNA琼脂糖凝胶电泳图

2.2 PCR产物的溶解曲线

从图2、图3 可知，内参基因β-Actin 和8 个处理的烟叶叶片的NtCIPK8基因的溶解曲线均为单一峰，没有其他峰的出现，同时图3中的峰的形状比较锐利，表明NtCIPK8基因在不同处理下的溶解温度均一性比较好，同时表明PCR 扩增产物的特异性好，没有出现非特异性扩增。

图2 溶解曲线1

图3 溶解曲线2

2.3 NtCIPK8基因扩增曲线

图4 的扩增曲线分成了3 个阶段，分别是荧光背景阶段、荧光信号指数扩增阶段及荧光信号扩增平稳期。基因扩增曲线整体光滑且平稳性较好，形状“S”完整性好，符合荧光定量检测的要求。

图4 基因扩增曲线

2.4 不同处理下烟叶团棵期叶片中NtCIPK8表达量

图5 结果表明：通过荧光定量PCR 数据发现在不同处理下团棵期的叶片中NtCIPK8均有表达，呈现了先上升后下降的趋势，不同处理后烟叶叶片团棵期NtCIPK8的表达存在差异。其中在处理T3（纯氮7.5 kg/667 m2）的叶片中NtCIPK8的表达量最高，处理T1（纯氮5.0 kg/667 m2） 的叶片中NtCIPK8的表达量最低。

图5 不同处理下团棵期的叶片中NtCIPK8表达量

3 结论与讨论

学生们通过独自提取RNA 并纯化、反转录、使用荧光PCR 仪扩增了8 个处理下烟叶中NtCIPK8的表达量，CIPKs 一类蛋白激酶家族，它是Ca2+感受器CBLs（Calcineurin B-like proteins，CBLs）的靶蛋白，CIPK与CBL 形成复合体[10]；Ca2+与CBL 结合后，CBLs 的构型发生变化，它的疏水性结合位点暴露到外面，疏水性结合位点与CIPKs 的NAF 结构域结合，促使CIPKs释放自抑制区，CBL/CIPK复合体被激活，从而调控细胞的代谢[11]。CIPK8 是CIPKs 的家族成员，它可能参与了植物的胁迫信号途径[12]，同学们通过独自提取RNA 并纯化、反转录、使用荧光PCR 仪扩增了8 个处理下烟叶中NtCIPK8的表达量，通过荧光定量PCR 扩增了8 个处理下烟叶中NtCIPK8的表达量不仅使学生们掌握了实验技术，还了解了不同施氮量下相同组织中同一个基因的表达量也会不同，将基因表达的特点从一个抽象的概念转化为了具体的数字图形。

由于涉及到引物的设计、内参基因的选择、RNA 样本制备及纯化、反转录cDNA、相对定量法中内参基因的校准和样品基因的定量检测，实验步骤繁琐，容易由于所使用的试剂及操作者的技术造成实验结果误差较大，甚至会出现失败的现象[13]。其中qRT-PCR 的引物设计和内参基因的选择至关重要，引物设计过程中设计到引物二聚体、发夹结构、非特异性扩增、退火温度的选择等，均会影响实验的结果[5]；筛选到合适的内参基因进行校正和标准化，可以给靶基因提供参考数据，同时可以消除因模板浓度不同带来的实验误差。提取样品RNA 的时候要特别注意RNA 的降解和污染，要使用无RNA 酶的器皿等。

本次实验是一次探索性的教学实验，由本科生为主体，老师作指导，综合一系列实验而最终获得结果，所得实验结果与研究生做的实验数据相一致，表明本科生通过提前预习、课堂讲解、实际操作是可以达到较高的水平的，这里也显示出实验整体设计的重要性，整个研究项目进行合理的规划设计就可以使得学生们容易操作，实验误差减少。

该实验项目具有较强的连贯性和综合性，虽然实验成本较高，对学生的理论知识和操作技能也都有较为严格的要求，但是我们应该以“双一流”学科建设和“新农科”人才培养为契机，以教育部《实验教学示范中心建设标准》《专业实验室评估标准》为标准，秉承传授知识、培养能力、提高素质的指导思想，紧紧围绕提高本科教学质量，建设高水平的农学类、生物类实验教学共享平台；深化实验教学改革和管理体制改革，构建与专业人才培养目标相适应的实验教学体系，建立功能完善、结构合理、管理高效的实验室运行机制和管理体系；优化实验队伍结构，提高实验教师专业技术水平，建立专兼职有机结合的高素质实验教学队伍；遵循“高起点、新思路、有特色、重效用”的原则，突出重点、分期建设，加强中心信息化、设备更新、创新实验室和实习基地等建设，夯实实验教学在创新人才培养等方面的重要作用。

4 结语

利用实时荧光定量PCR 技术检测基因表达量可以让学生快速地掌握基因表达检测技术，数字、柱形图等可以让学生直观地了解基因在器官和组织的表达状况。提高本科生培养质量，充分发挥实验室在实践和创新能力培养中的特殊作用，凸显本科教育的特色，提高学生的综合实验技能，以实验教学来进一步促进理论教学，同时能提高各专业学生解决具体问题的能力，为培养本科生创新意识和开展更深层次的研究工作打下良好的基础。