添加不同益生菌对桑枝叶发酵品质的影响

万 荣，黄 剑，苏桂梅，陈锦德，杨郑州，岑 宇

（百色学院农业与食品工程学院；百色学院亚热带特色农业产业学院；广西芒果生物学重点实验室，广西百色 533000）

种桑养蚕传统生产模式仅采叶养蚕，占桑树生物产量一半以上的桑枝没有得到充分利用，资源利用率极低，据廖森泰等（2009）测算，仅占其生物学产量的1%～3%。而开展桑树饲料化利用则是提高其利用率和经济效益的有效途径。桑叶及其嫩茎的粗纤维含量高达8%以上（李有业和耿凤琴，2009），如经微生物发酵处理（朱佳文等，2021；朱佳文等，2020；唐庆凤等，2018；董志浩等，2016），能有效降低粗纤维含量，提升粗蛋白质含量，营养价值改善明显。

青贮发酵成功与否的关键因素之一就是益生菌数量。王林等（2011）报道，乳酸菌青贮发酵苜蓿与玉米混合物的最低有效浓度应为原料鲜重的105CFU/g。单独添加106CFU/g桑叶鲜重的枯草芽孢杆菌明显提高了发酵品质（董志浩等，2016）。朱佳文等（2021、2020）研究表明，5×106CFU/g枯草芽孢杆菌和107CFU/g枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌复配菌提高了发酵桑叶粗蛋白质含量。但关于益生菌数量对桑枝叶发酵品质影响却鲜有报道。因此，本试验以桑枝叶为原料，探究添加不同浓度布氏乳杆菌或枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵品质的影响，旨在为桑叶发酵饲料开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验用的桑枝叶采自广西百色鑫桂科技有限公司，剔除主杆和发黄叶片，保留绿叶和尾端50 cm左右嫩枝。布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌购自南昌绿创生物技术有限公司。发酵饲料袋规格30 cm×40 cm，22丝。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 布氏乳杆菌或枯草芽孢杆菌发酵试验均采用单因素试验设计，每种益生菌均设4个处理组，每个处理组6个重复。对照组不添加任何益生菌；试验组使用布氏乳杆菌或枯草芽孢杆菌，添加量均分别为桑枝叶鲜重的1×106、1×108、1×1010CFU/g（见表 1）。

表1 添加不同益生菌对桑枝叶发酵品质影响试验设计 CFU/g

1.2.2 发酵料调制 带嫩枝50 cm的桑枝叶刈割后立即运回实验室，流水冲洗去除表面污物，置于阴凉处晾晒过夜，将其水分控制在50%～60%。用切碎机切碎至2.0～3.0 cm，将已切碎的原料随机分为6等份，按照试验设计，将益生菌干粉使用超纯水溶解后均匀喷洒到发酵原料上，对照组使用等量的超纯水进行喷洒，混合均匀。按照每袋原料500 g装入带放气阀的专用薄膜发酵饲料袋，人工压实后采用电热封口机密封袋口，在常温、避光条件下发酵15 d。随后开袋，分析发酵桑枝叶饲料各项指标。

1.2.3 样品制备 试验料发酵15 d后打开发酵袋，取出全部样品充分混匀，用四分法称取20 g放入三角烧瓶中，加入80 mL超纯水，4℃浸提24 h，然后用双层纱布和滤纸过滤，测定滤液pH。剩余的发酵桑枝叶样品收集起来65℃烘干，称重，用于干物质、粗蛋白质、粗脂肪、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的常规测定。

1.3 测定指标及方法 pH采用便携式pH计测定（型号HANNA HI-8424）；水分含量测定参照GB/T 6435-2014《饲料中水分的测定》；粗蛋白质含量测定采用凯氏定氮法，参照GB/T 6432-2018《饲料中粗蛋白质的测定方法》；粗脂肪含量测定采用索氏抽取法，利用脂肪测定仪进行分析检测（型号SOX606，购自山东海能科学仪器有限公司）；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量测定参照 Van Soest法（Van Soest等，1991），利用纤维测定仪进行分析检测（型号F800，购自山东海能科学仪器有限公司）。

1.4 数据统计与分析 试验数据整理后，采用SAS9.0进行单因素方差分析（ANOVA程序），采用Duncan’s法进行多重比较。试验结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中pH的影响 由表2可知，随着布氏乳杆菌添加量的增加pH不断降低，分别显著下降32.56%、34.88%和36.63%（P＜0.05）。而枯草芽孢杆菌组的pH仅106水平比对照组显著下降12.65%（P＜0.05），其余各组差异不显著（P＞0.05）。从试验结果看，枯草芽孢杆菌组pH下降幅度仅为布氏乳杆菌组的1/3左右，说明布氏乳杆菌的产酸能力明显强于枯草芽孢杆菌。

表2 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中pH的影响

2.2 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中粗蛋白质的影响 由表3可知，发酵15 d后，与对照组相比，不同浓度布氏乳杆菌组的粗蛋白质含量均显著高于对照组（P＜ 0.05），分别提高 11.38%、12.32% 和 13.56%。与对照组相比，枯草芽孢杆菌组也分别提高10.73%、10.17%和12.91%，但4个处理组之间差异不显著（P＞0.05）。

表3 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中粗蛋白质的影响

2.3 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中中性洗涤纤维的影响 由表4可知，与对照组相比，布氏乳杆菌或枯草芽孢杆菌处理桑枝叶均显著降低了中性洗涤纤维含量（P＜0.05）；其中，布氏乳杆菌组分别下降32.08%、28.52%和30.47%，枯草芽孢杆菌组下降27.99%、28.73%和31.42%。从下降幅度分析，布氏乳杆菌降解纤维的能力略强于枯草芽孢杆菌。

表4 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中中性洗涤纤维的影响 %

2.4 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中酸性洗涤纤维的影响 由表5可知，添加布氏乳杆菌或枯草芽孢杆菌均未显著降低发酵桑枝叶的酸性洗涤纤维含量，仅呈现略微下降的趋势，所有处理组间差异不显著（P＞0.05）。

表5 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中酸性洗涤纤维的影响 %

2.5 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中粗脂肪的影响 由表6可知，与对照组相比，布氏乳杆菌或枯草芽孢杆菌处理桑枝叶均显著降低了粗脂肪含量（P＜0.05），其中，布氏乳杆菌组分别下降73.02%、58.20%和57.41%，枯草芽孢杆菌组则下降68.78%、52.12和62.17%。以上结果说明，布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌均具有很强的降解粗脂肪的能力。

表6 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中粗脂肪的影响 %

2.6 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中干物质的影响 由表7可知，枯草芽孢杆菌组发酵桑枝叶干物质含量显著高于对照组（P＜ 0.05），分别升高 50.47%、56.79% 和57.49%（P＜0.05）。而布氏乳杆菌组的干物质含量仅106水平比对照组显著升高16.33%（P＜0.05），其余各组差异不显著（P＞0.05）。以上结果表明，枯草芽孢杆菌具有增加发酵桑枝叶干物质含量的能力，而布氏乳杆菌没有。

表7 不同浓度布氏乳杆菌和枯草芽孢杆菌对桑枝叶发酵过程中干物质的影响 %

3 讨论

本研究结果发现，布氏乳杆菌能明显降低桑枝叶青贮发酵饲料pH，随着布氏乳杆菌添加量的增加，pH不断降低，这与何玮等（2021）研究结果一致，当布氏乳杆菌添加量大于105CFU/g（鲜重）时，玉米青贮发酵饲料品质稳定性明显增强，直到503 h才发霉变质。但枯草芽孢杆菌试验组pH仅106水平比对照组显著下降12.65%，下降幅度仅为布氏乳杆菌组1/3左右。pH是衡量发酵饲料品质优劣的关键指标之一，说明布氏乳杆菌产酸能力明显强于枯草芽孢杆菌。布氏乳杆菌在发酵过程中能将糖类转化成乳酸等，从而明显改变发酵桑枝叶pH，提高有氧稳定性防止变质（玉柱和孙启忠，2011；洪梅等，2011）。添加布氏乳杆菌的发酵桑枝叶粗蛋白质含量显著升高，中性洗涤纤维和粗脂肪含量显著降低，这与布氏乳杆菌在杂交狼尾草（何玮等，2021）、玉米秸秆（刘辉等，2021）、高粱（孙向丽等，2021）和马铃薯藤（刘齐光，2021）中的青贮发酵结果类似。由此可见，布氏乳杆菌能改善原料青贮的发酵品质，提升其营养价值。添加枯草芽孢杆菌的桑枝叶，粗蛋白质含量分别提高10.73%、10.17%和12.91%，粗脂肪显著降低，与朱佳文等（2020，2021）的试验结果一致，但统计上不如布氏乳杆菌的差异显著。可能是因为枯草芽孢杆菌缺乏产酸能力，随着桑枝叶发酵时间延长至15 d时，发酵饲料pH偏高，难以抑制有害微生物生长，导致枯草芽孢杆菌自身活性受到严重影响，其产酶能力下降，限制了其提高粗蛋白质的能力。

此外，本试验结果发现，添加枯草芽孢杆菌能明显提高发酵桑枝叶的干物质含量，这与朱佳文等（2020）的研究结果一致。添加布氏乳杆菌则影响很小，仅106水平比对照组显著升高16.33%，升高幅度也只是枯草芽孢杆菌组的1/3左右。这可能是因为枯草芽孢杆菌在发酵繁殖过程中能产生众多次级代谢产物和菌体蛋白，使得干物质含量明显增多。另一方面原因是布氏乳杆菌本身会造成发酵饲料的干物质损失。

4 结论

本试验结果表明，两种益生菌106CFU/g（鲜重）添加水平就能显著改善桑枝叶的发酵品质；布氏乳杆菌的产酸能力和提升粗蛋白质含量的能力均明显强于枯草芽孢杆菌，添加布氏乳杆菌处理桑枝叶的发酵品质优于枯草芽孢杆菌。