厦门希瓦氏菌临床株对碳青霉烯类耐药的分子机制

刘艳飞，刘真真，吕金峰，吕薏潼，房钰良，朱元祺,*

(1.青岛大学附属医院，山东 青岛266003;2.青岛大学医学部检验系，山东 青岛 266071;3.青岛市妇女儿童医院 山东 青岛266034;4.香港城市大学 生物科学专业)

希瓦氏菌属是于1985年建立的新属，目前有70余个种[1]。希瓦氏菌属于非发酵菌，广泛分布于自然界。其中，与临床感染相关的主要是腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)、海藻希瓦氏菌(Shewanellaalgae)、奥奈达希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)和厦门希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)。希瓦氏菌可引起人的中耳炎、血流感染、肝胆系统感染以及皮肤和软组织的感染[2]。到目前为止，国内外关于厦门希瓦氏菌引起人体临床感染的报道相对较少。因此，本文对临床分离的一株耐碳青霉烯类希瓦氏菌HDC555进行分子鉴定、药敏表型和产碳青霉烯酶检测，以及对菌株的基因组序列进行测序和分析，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验和药敏质控菌株希瓦氏菌HDC555株分离自肺部感染患者的痰液。S1核酸酶切脉冲场电泳的分子量标记沙门菌H9812和药敏质控菌株ATCC 25922为本实验室保存。

1.2 仪器与试剂生物梅里埃公司VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统。药敏结果判定依据CLSI-2021标准[3]。美国BIO-RAD公司脉冲场电泳系统和凝胶成像仪。其他试剂为Takara公司。

1.3 菌株碳青霉烯酶的筛选分别通过mCIM/eCIM(改良碳青酶烯灭活试验/EDTA改良碳青酶烯灭活试验)和免疫金标法筛选菌株产生的碳青霉烯酶。mCIM/eCIM实验操作步骤和结果判定依据CLSI-2021标准[3]。免疫金标法试剂分别为上海复星NG-Test CARBA 5试剂卡(批号W20040311)和北京金山川碳青霉烯酶检测卡(批号201031)，这两个厂商的试验卡的实验步骤和结果判定按照试剂盒内提供的说明书进行。

1.4 S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)希瓦氏菌HDC555携带质粒的检测通过S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳，具体操作参照文献[4]。

1.5 希瓦氏菌HDC555的高通量测序基于Illumina和Nanopore技术平台对HDC555株进行测序，然后对获得的序列利用一系列软件分析菌株的生物学信息。Inkscape0.48.1软件绘图。

2 结果

2.1 菌株的药敏和碳青霉烯酶检测结果

希瓦氏菌HDC555对头孢唑啉、头孢曲松、头孢他啶、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星和磺胺甲恶唑/甲氧苄啶哌耐药，但对哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、头孢吡肟、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素和左氧氟沙星敏感。

mCIM/eCIM实验显示希瓦氏菌HDC555的mCIM和eCIM都是阳性，按照CLSI-2021中结果判读标准，在该株菌中检出金属β-内酰胺酶。然而，在免疫金标法试验中，上海复星NG-Test CARBA 5试剂卡和北京金山川NDM碳青霉烯酶检测卡以及OXA-48碳青霉烯酶检测卡显示都显示该株菌产碳NDM和OXA-48碳青霉烯酶。此外，北京金山川OXA-23碳青霉烯酶检测卡显示阴性，即，北京金山川OXA-23碳青霉烯酶检测卡与OXA-48碳青霉烯酶检测卡之间没有呈现交叉反应。实验结果见图1。

图1 希瓦氏菌HDC555碳青霉烯酶检测结果图

2.2 菌株的S1-PFGE和高通量测序结果

S1-PFGE显示希瓦氏菌HDC555株携带一个大约217 kb的质粒,见图2。高通量测序获得了该菌的染色体和携带的1个质粒的序列，分别命名为HDC555-chr和pHDC555-1。通过ANI比对，原VITEK 2 Compact仪器鉴定HDC555株为腐败希瓦氏菌实际上是厦门希瓦氏菌。另外，质粒pHDC555-1的序列长度为217 441 bp，与S1-PFGE显示的质粒大小相一致。此外，序列分析显示厦门希瓦氏菌HDC555携带blaOXA-199和blaNDM-1基因，并分别位于染色体和质粒上，其他耐药基因和信息见表1。

图2 S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳

表1 厦门希瓦氏菌HDC555株的生物信息分析结果

通过NCBIblast比对，HDC555的blaOXA-199区域与厦门希瓦氏菌WCJ25(JN704570.1)的blaOXA-199区域[5]高度相似,但与厦门希瓦氏菌S4(JX644945.1)的blaOXA-48区域[5]相似度稍低。blaOXA-199与blaOXA-48周围环境区别主要是ISSheS2插入到了blaOXA-199的下游，见图3。

图3 HDC555与WCJ25和S4的MDR部分区域比较图

质粒pHDC555-1的MDR区域含有blaNDM-1和blaCARB-2两个耐药基因。blaNDM-1对应区域源自Tn125转座子，而其blaCARB-2区域与PGI2-C74(MK847916.1)的对应核酸序列[6]高度相似。另外，blaNDM-1和blaCARB-2这两个耐药基因所在区域由插入序列IS26相连接，见图4。

图4 pHDC555-1与PGI2-C74的blaCARB-2区域比较

3 讨论

隶属于希瓦氏菌属的厦门希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)是Huang 于2010年首次报道[7]。该菌株分离于福建省厦门沿海的海洋沉积物。目前，临床上应用的微生物自动鉴定系统不能对希瓦氏菌属进行正确地鉴定，使得一些新菌种被误鉴定为腐败希瓦氏菌或海藻希瓦氏菌[8-9]。本研究的希瓦氏菌HDC555经VITEK 2 Compact仪器最初鉴定为腐败希瓦氏菌，但通过平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)比对，希瓦氏菌HDC555全基因组与厦门希瓦氏菌基因组的OrthoANIu value高达97.41%，即，原VITEK 2 Compact自动仪鉴定HDC555株为腐败希瓦氏菌实际上是厦门希瓦氏菌。另外，厦门希瓦氏菌HDC555全基因组测序数据经分析显示：①HDC555-chr序列长度为5023 766 bp,blaOXA-199基因位于该染色体上;②质粒pHDC555-1的长度为217 441 bp，除了与S1-PFGE显示的质粒大小相一致外，blaNDM-1和blaCARB-2这两个耐药基因都位于质粒上。

Zong于2012年首次报道[5]携带blaOXA-199基因的厦门希瓦氏菌。该菌分离自一位胰腺炎患者术后所放置的胰周引流管。通过NCBIblast比对，HDC555的blaOXA-199区域长度为11 940 bp，与厦门希瓦氏菌WCJ25(GenBank No：JN704570.1)的blaOXA-199区域高度相似(coverage100%,identity99.96%),但与厦门希瓦氏菌S4(GenBank No：JX644945.1)的blaOXA-48区域相似度稍低(coverage78%,identity 96.70%)。blaOXA-199上游毗邻orf(编码肽酶)、sprT(编码功能未知蛋白)、endA(编码内切核酸酶)、rsmE(编码核糖体RNA甲基转移酶)，下游与ISShes2(插入序列)、lysR(转录调节因子基因)、acc(乙酰辅酶A羧化酶编码基因)相邻。blaOXA-199和blaOXA-48周围环境高度相似，区别主要在于ISSheS2插入到了blaOXA-19的下游(图3)。

blaCARB-2耐药基因是染色体盒(chromosomal cassette)的一部分，早期曾被确认为blaPSE-1基因[10-11]。关于该基因在不同的菌种和国家分布的报道不多。到目前为止，已有报道在鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、皮特不动杆菌和多噬伯克霍尔德菌中有检出blaCARB-2基因[12-13]，但在厦门希瓦氏菌中检出blaCARB-2耐药基因尚未见报道。此外，在希瓦氏菌中检出blaNDM-1基因也比较少。到目前为止，仅仅Potter于2017年报道1株腐败希瓦氏菌SA70株携带了位于染色体上的blaOXA-436基因和位于质粒上的blaNDM-1基因，且该SA70株分离自巴基斯坦一所教学医院重症监护室的水槽把手[14]。除了blaOXA-199基因外，也有报道厦门希瓦氏菌携带其他D类碳青霉烯酶耐药基因，如blaOXA-181、blaOXA-416blaOXA-538和blaOXA-894基因[15-18]。

本研究中的厦门希瓦氏菌HDC555携带有一个质粒(pHDC555-1)。测序数据经分析显示，该质粒的MDR(多重耐药)区域含有blaNDM-1和blaCARB-2两个耐药基因：blaNDM-1对应区域源自Tn125转座子，基因结构为dsbD-trpF-bleMBL-blaNDM-1-ΔISAba125;blaCARB-2对应区域与PGI2-C74(GenBank No：MK847916.1)的对应核酸序列高度相似，PGI2-C74包含一个Ⅰ类整合子，基因结构为dfrA16-blaCARB-2-aadA2-cmlA1-aadA1，并且已有研究表明PGI2-C74可以从奇异变形杆菌成功地结合转移到大肠埃希菌[6]。另外，在质粒pHDC555-1中，blaNDM-1和blaCARB-2这两个耐药基因所在区域由插入序列IS26相连接，Ⅰ类整合子的组件和插入序列 IS26之间的同源重组可能促进了MDR 区域的多样性(图4)。

值得注意的是厦门希瓦氏菌HDC555对头孢三代和碳青酶烯类的厄他培南、亚胺培南和美罗培南耐药，但对哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、头孢吡肟敏感，其原因有待于进一步研究。另外，按照CLSI-2021中推荐的mCIM/eCIM实验方法，在希瓦氏菌HDC555仅仅中检出金属β-内酰胺酶(尽管在指南[3]中已经提示该方法对产两种碳青霉烯酶的细菌会有假阴性)，而在免疫金标法中显示该菌携带两种碳青霉烯酶。因此，在临床工作中，有必要将这两种方法相互结合，以增加检出的阳性率。

综上所述，厦门希瓦氏菌未来有可能成为引起临床感染的潜在重要病原菌。经检索，同时携带了blaOXA-199、blaNDM-1和blaCARB-2耐药基因的厦门希瓦氏菌引起的临床感染为国内外首次报道。