阿尔茨海默病-痰瘀互结病证结合动物模型的建立与评价

谭爱华 冉思邈 石和元杨 硕*

(1.湖北中医药大学附属黄冈中医医院,湖北 黄冈 438000；2.湖北中医药大学老年医学研究所,武汉 430065；3.北京中医药大学博士后流动站,北京 100029)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种认知及行为障碍进行性加重的神经系统疾病[1]。据2018 国际阿尔茨海默病报告显示,全球共有5000 万AD 患者,平均每3 s 就能增加一例新患者[2]。年龄是AD 的重要发病因素,随着我国老龄化的加剧,我国将成为AD 的重灾区[3]。AD 属中医学中“痴呆”“健忘”“不慧”等范畴,“痴呆”之名首见于《华佗神医秘传·治痴呆神方》[4]。AD 病机总属本虚标实,肾精不足为发病基础,痰、瘀为主要致病因素,痰瘀互结,经脉不畅,精元不能上达于脑,脑窍失养,发为本病[5]。目前AD-痰瘀互结证尚无标准动物模型,本研究以APP/PS1 双转基因小鼠为AD 模型动物,通过冰水浴联合高脂饮食饲喂干预,构建AD-痰瘀互结模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物

20 只SPF 级3 月龄APP/PS1 双转基因雄性小鼠,5 只SPF 级3 月龄同遗传背景的C57BL/6J 雄性小鼠,体重均为(25±5)g,均订购于北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008],饲养于湖北中医药大学实验动物中心SPF 级屏障环境独立通气笼中[SYXK(鄂)2017-0067]。饲养室温度22℃～25℃,湿度45%～55%,12 h/12 h 昼夜交替。本研究通过了湖北中医药大学动物实验伦理审查([2020]IEC(012)号),实验期间按照3R 原则给予小鼠人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

小鼠血生化检测试剂集成夹片(美国IDEXX)；RIPA 裂解液、50×cook tail、PMSF(100 mmol/L)、磷酸化蛋白酶抑制剂、BCA 蛋白定量检测试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、脱脂奶粉、ECL、显影定影试剂、β-actin、GAPDH、Histone H3、HRP 标记山羊抗兔、HRP 标记驴抗山羊、HRP标记山羊抗小鼠、HRP 标记山羊抗大鼠、转移缓冲液、电泳缓冲液、TBS 缓冲液均由武汉Servicebio 公司提供；PVDF 膜(Millipore,0.45 μm,0.22 μm)；TWEEN 20 (Solarbio,T8220)；T-Tau 抗体(Servicebio,GB11178)；TNF-α 抗 体(武汉三鹰,17590-1-ap)；IL-10(武汉三鹰,60269-1-ap)；IL1-β(武汉Abclonal,A11369)。

动物独立通气笼架(浙江苏杭,IVC-BP5 型)；高脂饲料(北京华阜康,D12492)；制冰机(广州思克,MIYA-ICS60 型)；玻璃筒(四川蜀牛,60 cm/1500 mL)；Morris 水迷宫视频分析系统(安徽正华,ZH0065 型)；血流变分析仪(北京赛科希德,SA-7000)；Catalyst one 动物全自动生化分析仪(美国IDEXX)；酶标检测仪(BIO-RED)；冷冻离心机(湖南凯达)；双垂直电泳仪(BIO-RED)；转印电泳仪(BIO-RED)；感光胶片(日本kodak)；灰度分析软件(美国Protein Simple,Alpha Ease FC)；匀浆仪(上海测博)；数码单反相机、镜头(日本Canon,EOS 6D Mark Ⅱ；24～70 mm f/2.8 L USM)；140 Color Checker(美国,X-RITE)；D65 国际标准人工日光灯管(荷兰PHILIPS,6500 k/18 w/30 cm)；摄影箱(浙江昕昱发,Hakutatz 101260cm/LED)；图片分析软件Photoshop CC(美国Adobe)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组

按照随机数表法将20 只APP/PS1 双转基因小鼠分为4 组:AD-疾病模型组(Alzheimer’s disease model group,记作AD-Model 组)、AD-痰证组(ADPhlegm syndrome group,记作AD-Ps 组)、AD-瘀证组(AD-Blood stasis syndrome group,记作AD-Bss 组)、AD-痰瘀互结组(AD-Phlegm and blood stasis group,记作AD-Pbs 组),每组5 只。同系非转基因C57BL/6J 小鼠5 只作为空白对照组(Blank control group,记作Control 组)。

1.3.2 实验动物造模

各组小鼠适应性喂养1 周后开始造模。AD-Ps组小鼠于入室后第8 天开始饲喂高脂饮食,自由饮水,持续14 d。AD-Bss 组小鼠于入室后第8 天开始,每天14:00,将小鼠放入底面直径为10 cm、深25 cm、壁厚0.2 cm 的玻璃圆桶内,冰水混合物深12 cm 左右,以小鼠后肢不能直接触到桶底为宜,冰水混合物温度控制在0℃～4℃。待小鼠在冰水混合物中挣扎动作明显减少,即将沉至桶底时立即捞出。每天1 次,持续14 d[6]。AD-Pbs 组同时予高脂饮食和冰水浴处理,持续14 d。AD-Model 组和Control组正常饲养,不予处理。

1.3.3 模型评价

(1)Morris 水迷宫法检测各组小鼠行为学变化

测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分,主要检测小鼠的运动能力及空间记忆能力。定位航行试验共历时5 d,每天训练4 次。记录最后一日上平台潜伏期(单位:s),同时记录各组小鼠抵达平台前或90 s 内游泳的总路程(单位:cm),计算平均游泳速度(单位:cm/s)。记录每只小鼠在水池中的运动路线,生成定位航行试验运动轨迹图。空间探索试验在定位航行试验后,撤去池中水下平台,记录各组小鼠穿越原平台所在位置的次数,记作穿越平台次数(单位:次),并记录每只小鼠在水池中的运动路线,生成空间探查试验运动轨迹图。

(2)分析比色反应各组小鼠舌色客观变化

将小鼠用0.3%的戊巴比妥钠溶液(0.15 mL/10 g)麻醉术后移入摄影箱内,充分暴露小鼠舌头,标准人工日光下拍照。相同条件下,拍摄140 色Color Checker 标准比色卡。用 Photoshop CC(Adobe)处理小鼠舌面区域图像,统一调整为成大小为500×500 px 的图片,颜色选择sRGB 模式。校正拍摄的标准比色卡,将校正后的各组小鼠舌象图片分隔为5×5 的区域,分别提取每个区域中心位置R、G、B 数值并计算平均值和r 值,r=R/(R+G+B),用于反映各组小鼠舌色的客观变化。

(3)血液流变学反应各组小鼠血液粘稠度

各组小鼠实验前撤去食物,禁食12 h,不禁水。将小鼠用0.3%的戊巴比妥钠溶液(0.25 mL/10 g)麻醉术后,心脏采血,分装为两支,其中一支置于含有肝素的抗凝管中,血液流变分析仪分别检测血液高切(200/s)、中切(50/s)、低切(1/s)的全血黏度及血浆黏度。

(4)生化分析反应各组小鼠血脂变化

上述采得另外一支血液,分离血清,Catalyst one全自动生化分析仪,分别测定各组小鼠血清中的TC、TG、HDL-C 和LDL-C 的含量。

(5)Western blot 法检测各组小鼠海马组织相关蛋白含量

采血后的小鼠迅速断头取脑,剥离出海马组织,提取海马组织总蛋白,用Western blot 法检测TNF-α、IL-1β 及T-Tau 蛋白含量。

1.4 统计学方法

所有实验数据均使用SPSS 23.0 软件进行分析,Graph Pad Prism 8.0 软件和Adobe AI 2020软件绘制统计图。结果以平均数±标准差()表示,所有数据均保留小数点后3 位。方差齐性检验P＞0.05 时,采用t检验,方差齐性检验P＜0.05 时采用T2检验；两组间比较采用LSD。以P＜0.05 判定差异为有统计学意义,P＜0.01 判定为差异具有高度统计学意义,P＞0.05 判定为差异无统计学意义。

2 结果

2.1 Morris 水迷宫实验结果

与Control 组小鼠比较,AD 各组小鼠的平均游泳速度差异无统计学意义(P＞0.05)。AD 各组小鼠的游泳总路程和上平台潜伏期明显更多,穿越平台次数明显更少,其差异具有统计学意义(P＜0.05)。

与AD-Model 组小鼠比较,各组小鼠的平均游泳速度差异无统计学意义(P＞0.05)。AD 各组小鼠的游泳总路程、上平台潜伏期和穿越平台次数差异无统计学意义(P＞0.05)。

说明各组小鼠运动能力没有明显差异。与C57小鼠相比,APP/PS1 双转基因小鼠的学习记忆能力明显降低,从统计数据来看,虽然冰水浴和高脂饮食造模处理后的各组小鼠学习记忆能力存在一定的差异,但这些差异并没有统计学意义(P＞0.05)。统计结果如表1,各组小鼠定位航行试验和空间探查试验的运动轨迹代表图如图1。

图1 各组小鼠Morris 水迷宫试验轨迹图Note.Upper figure,Positioning navigation test.Lower figure,Space exploration test.Figure 1 Action trajectory diagram of each group of mice in Morris test

表1 各组小鼠Morris 水迷宫检测结果(,n=5)Table 1 Results of Morris maze test for each group of mice

表1 各组小鼠Morris 水迷宫检测结果(,n=5)Table 1 Results of Morris maze test for each group of mice

注:与空白对照组比较,*P＜0.05；与AD-疾病模型组比较,△P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared of with the AD-Model group,△P＜0.05.

2.2 舌色客观化比较实验结果

与Control 组小鼠相比,AD-Model 组小鼠舌色偏暗红,但r 值差异并没有统计学意义(P＞0.05)。其余各组小鼠舌色偏暗红,r 值差异有统计学意义(P＜0.05)。

与AD-Model 组小鼠相比,AD 各组小鼠舌色偏暗红,r 值差异有统计学意义(P＜0.05)。对AD-Ps组、AD-Bss 组和AD-Pbs 组进行两两LSD比较,ADPs 组、AD-Bss 组小鼠舌色无明显差异,r 值差异也没有统计学意义(P＞0.05),而AD-Ps 组和AD-Pbs组、AD-Bss 组和AD-Pbs 组之间的差异具有统计学意义(P＜0.05)。各组小鼠舌面R、G、B 值及r 值统计表见表2,小鼠舌象图片见图2。

图2 各组小鼠舌象图片Figure 2 Tongue images of mice in each group

表2 各组小鼠舌面R、G、B 值及r 值(,n=5)Table 2 R,G,B and r values of the tongue photos of mice in each group

表2 各组小鼠舌面R、G、B 值及r 值(,n=5)Table 2 R,G,B and r values of the tongue photos of mice in each group

注:与空白对照组比较,*P＜0.05；与AD-疾病模型组比较,△P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared of with the AD-Model group,△P＜0.05.

2.3 血液流变学检测实验结果

与Control 组小鼠相比,AD-Model 组与AD-Ps 组小鼠全血黏度和血浆黏度较高,但其差异无统计学意义(P＞0.05)。AD-Bss 组和AD-Pbs 小鼠全血黏度和血浆黏度明显升高,具有统计学意义(P＜0.05)。

与AD-Model 组小鼠相比,AD-Ps 组小鼠的全血黏度和血浆黏度均有不同程度升高,但其差异不具有统计学意义(P＞0.05)；AD-Bss 组和AD-Pbs 小鼠全血黏度和血浆黏度明显升高,具有统计学意义(P＜0.05)。这说明冰水浴处理可以明显改变小鼠的血液流变,能够较好地模拟“瘀”的病理状态。各组小鼠全血黏度和血浆黏度比较见表3。

表3 各组小鼠全血黏度、血浆黏度比较(,mpa/s,n=5)Table 3 Comparison of whole blood viscosity and plasma viscosity of mice in each group

表3 各组小鼠全血黏度、血浆黏度比较(,mpa/s,n=5)Table 3 Comparison of whole blood viscosity and plasma viscosity of mice in each group

注:+:进行冰水浴处理,-:不进行冰水浴处理。各组小鼠与空白对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01；与AD-疾病模型组组比较,△P＜0.05,△△P＜0.01。Note.+,Ice and water mixture treatment.-,No Ice and water mixture treatment.Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Compared of with the AD-Model group,△P＜0.05,△△P＜0.01.

2.4 血脂检测实验结果

与Control 组小鼠相比,AD-Model 与AD-Bss 组小鼠血脂指标差异无统计学意义(P＞0.05)。ADPs 组和AD-Pbs 组小鼠的各项血脂指标均明显升高,差异均具有高度统计学意义(P＜0.01)。

与AD-Model 组小鼠相比,AD-Bss 组小鼠虽然在血脂指标上略有升高,但其差异不具有统计学意义(P＞0.05)。AD-Ps 组和AD-Pbs 组小鼠的各项血脂指标均明显升高,差异均具有高度统计学意义(P＜0.01)。

对AD-Ps 组和AD-Pbs 组进行LSD分析,两者之间的差异不具有统计学意义(P＞0.05)。这说明高脂饮食饲喂可以明显改变小鼠的血脂指标,能够较好地模拟“痰”的病理状态。各组小鼠血脂指标比较见表4。

表4 各组小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平比较(,mmol/L,n=5)Table 4 Comparison of serum levels of TC,TG,HDL-C and LDL-C in various groups of mice

表4 各组小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平比较(,mmol/L,n=5)Table 4 Comparison of serum levels of TC,TG,HDL-C and LDL-C in various groups of mice

注:各组小鼠与空白对照组组比较,**P＜0.01；与AD-疾病模型组组比较,△△P＜0.01。Note.Compared with the control group,**P＜0.01.Compared of with the AD-Model group,△△P＜0.01.

2.5 Western blot 实验结果

与Control 组相比,APP/PS1 双转基因的各组小鼠的海马组织的炎症指标TNF-α、IL-1β 和AD 病理改变指标T-Tau 均明显升高,其差异均有统计学意义(P＜0.05),这说明转基因小鼠海马组织内发生了炎症反应,并产生了AD 样病理改变。与ADModel 组比,AD-Bss 组和AD-Ps 组在炎症指标和AD 病理改变指标上虽然略有区别,但其差异不具有统计学意义(P＞0.05)；而AD-Pbs 组中的炎症指标和AD 病理改变指标明显升高,其差异具有统计学意义(P＜0.05)。这说明同时模拟“痰”和“瘀”病理状态的小鼠AD 病变程度更为严重,脑神经炎症的发生更加明显。各组小鼠海马区不同蛋白WB 电泳条带图和相对灰度值统计见图3。

图3 各组小鼠TNF-α、IL-1β、T-Tau 蛋白表达水平比较Note.A,Western blot electrophoresis band of different proteins in the hippocampal region of each group of mice.B,Relative grayscale values of different proteins in the hippocampal region of each group of mice.Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Compared of with the AD-Model group,△P＜0.05.Figure 3 Comparison of TNF-α,IL-1β and T-Tau protein expression levels in various groups of mice

3 讨论

AD 是一种神经系统疾病,以记忆减退、痴呆、生活能力减弱等为主要临床表现。目前,其发病机制尚不确切,主流观点认为炎症反应、Tau 蛋白的过度磷酸化、氧化应激等均可对其造成影响[7]。中医学认为,老年人脾肾虚弱,无力运化水湿,聚湿成痰。《辨证录》记载:“痰积于胸中,盘踞于心外,使神明不清而成呆病矣”。老年人气血虚弱,无力推动血液流转,血停则成瘀。《景岳全书》曰:“凡心有瘀血,亦令健忘”[8]。痰瘀互结,阻滞经脉,使气血精微不能上达脑窍,脑失所养,发为本病。因此,本研究以痰瘀互结证为切入点,建立AD-痰瘀互结证病证结合动物模型。

《医林改错·积块》曰:“血受寒则凝结成块”。寒邪克表,引起经脉痉挛、瘀阻,血行不畅,进而形成瘀证。郭文鹤、王丹丹等通过降低大鼠体表温度,获得瘀证动物模型[9-10]。对于瘀证动物模型的评价可以观察舌苔的改变,也可通过检测血液流变学的改变,常选取的指标有血液粘稠度、血浆粘稠度、血沉等[11]。“脾为生痰之源”,过食肥甘厚腻,损伤脾胃,而致脾胃生化失司,聚液为痰。彭丹虹等通过喂养大鼠高脂饮食,可以获得以血脂升高为主的痰证动物模型[12]。Lee 等[13]、Han 等[14]通过喂养小鼠高脂饮食,可以稳定的升高小鼠血脂。痰证动物模型的评价,主要通过检测血脂的改变[15]。辨证论治为中医的核心思想,以往涉及到AD 的动物实验主要以病为主,鲜有症状的辨识。痰瘀互结为AD 的主要症状,本次研究主要通过冰水浴加高脂饮食干预APP/PS1 双转基因小鼠来制造AD-痰瘀互结证动物模型。通过观察小鼠舌色变化、血液流变学改变、血脂改变等评价造模情况,通过水迷宫实验以及Western blot 实验评价AD-痰瘀互结证小鼠与正常小鼠的差别。

本次研究结果表明,与Control 组相比较,AD 各组小鼠的平均游泳速度无明显差异,表明各组小鼠的运动能力无差别。但AD 各组小鼠游泳总路程和上平台潜伏期明显增多,穿越平台次数明显减少,表明APP/PS1 双转基因小鼠的学习记忆能力明显降于C57 小鼠[16]。AD 各组小鼠的TNF-α、IL-1β、T-Tau 的蛋白含量明显高于Control 组,表明AD 各组小鼠海马组织内发生了炎症反应,并产生了AD样病理改变[17-18]。说明本次实验中AD 各组小鼠模型均符合阿尔茨海默病的临床表现。其中,ADPbs 组各项指标改变最为明显,其AD 病变程度更加严重。

未经过冰水浴及高脂饮食干预的AD-Model 组与Control 组在舌色、血液流变学及血脂方便无明显差别,表明在干预之前,小鼠无“痰”、“瘀”证的表现。干预之后,与AD-Model 组相比较,AD-Bss 组、AD-Ps 组及AD-Pbs 组小鼠舌色均偏暗红,AD-Bss组与AD-Pbs 组全血黏度和血浆黏度均升高,AD-Ps组与AD-Pbs 组血脂均升高,其中AD-Pbs 组不但舌色更加暗红,而且全血黏度、血浆黏度、血脂均明显升高。实验表明只接受冰水浴的小鼠,只会形成“瘀”证的病理表现,只接受高脂饮食的小鼠,只会形成“痰”证的病理表现,只有同时接受冰水浴及高脂饮食的小鼠才能形成“痰瘀互结”的病理表现,而且痰瘀症状相互搏结,瘀阻经脉,致使“痰”、“瘀”症状表现的更加明显。

本次研究在借鉴以往“痰”、“瘀”动物模型的基础上,结合AD 病因病机特点,创立AD-痰瘀互结证动物模型。与普通APP/PS1 双转基因小鼠相比较,本模型更加贴合中医辨证论治的思维体系,为相关中药或方剂研究提供更加准确的动物模型,以期达到方证对应。本模型制备可控性强,能做到统一化建模,且其证候表现与临床较一致。同时该方法也存在一定的缺点,如造模时间长,操作过程精细,过程繁琐等。通过以上分析,AD-痰瘀互结证动物模型可为相应研究提供可靠的动物载体。