慢病毒介导的HNRNPK 下调对肝癌细胞HepG2 增殖及迁移的影响

李梦媛,张文龙,杨星九,朱紫薇,张国新,魏育敏,高 苒

(中国医学科学院医学实验动物研究所,国家人类疾病动物模型资源库,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100021)

核不均一核糖核蛋白 K (heterogeneous nuclearribonucleoprotein K,HNRNPK)是一种能够在细胞质和细胞核中穿梭的高度保守的RNA 结合蛋白,属于hnRNPKs 家族成员。HNRNPK 在人类基因中广谱表达,能够作用于细胞的转录、翻译、染色体重塑等多种生理功能[1-2]。HNRNPK 能够参与肿瘤生长和转移等调控,多种肿瘤的形成和发展都与HNRNPK 密切相关[1-4]。当前研究显示,HNRNPK在人肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、宫颈癌等多种肿瘤中异常表达,其表达增多通常与恶性肿瘤患者的预后负相关[3-4]。原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是世界最高发的恶性肿瘤之一,在全球恶性肿瘤发病率中位居第5 位,其发病机制复杂,死亡率高,且发病率逐年上升[5]。已有研究证实HNRNPK 在肝癌组织细胞核中表达上调,并且随着肝癌细胞密度的增加,表达逐渐增强,乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染还有可能会促进HNRNPK 的表达[6]。目前,HNPNPK在肝癌发生发展中的分子机制尚未完全明确。本研究构建了通过强力霉素(doxycycline,DOX)诱导系统实现时间可控性HNRNPK 沉默的HepG2 细胞稳转株,为研究肝癌发病机制与治疗手段提供了实验工具。

1 材料和方法

1.1 细胞

HepG2 细胞系为本实验室冻存。

1.2 主要试剂与仪器

TRIzol 试剂、反转录试剂盒购自Thermo 公司；SYBR green 荧光染料购自Toyobo 公司；HNRNPK抗体、HRP 标记的二抗购自Abcam 公司；c-Myc、c-Jun 等抗体购自CST 公司；CCK-8 试剂盒购自东仁化学科技有限公司；定量PCR 专用96 孔板购自Life公司；细胞培养板、Transwell 嵌套24 孔板等购自Corning 公司。实时荧光定量PCR 仪和酶标仪购自BIO RAD 公司；拍照显微镜为Zeiss Axio Imager Z2光学显微镜。

PCR 实验所用引物由英潍捷基公司合成。HNRNPK 的siRNA 序列为5’-GAGCTTCGATCAAAA TTGA-3’,由本实验室设计并提供给吉凯基因进行慢病毒载体的构建。

1.3 实验方法

1.3.1 稳转株的构建

按吉凯基因操作手册进行HepG2 细胞的转染。将处于对数生长期的HepG2 细胞接种于6 孔板,18 h 后,加入MOI=10 的病毒,8 h 后更换新鲜的培养基。并在72 h 后,用工作浓度为2 μg/mL 的嘌呤霉素继续筛选48 h。观察细胞状态,用含有1 μg/mL嘌呤霉素的培养基维持并扩大培养阳性细胞。

1.3.2 HNRNPK 下调的HepG2 细胞的形态观察

将构建的HepG2 稳转株细胞接种于细胞培养板,用DOX 诱导HNRNPK 下调。48 h 后观察HNRNPK 下调后HepG2 细胞的形态。

1.3.3 Real time PCR 检测HNRNPK 的下调水平

将构建的HepG2 稳转株细胞接种于12 孔板,分别用0、1、2、5、10 μg/mL 浓度的DOX 诱导HNRNPK 下调。48 h 后,使用TRIzol 试剂裂解细胞并提取RNA,并进行反转录。采用Real-time PCR检测HNRNPK mRNA 的相对表达量。HNRNPK 与GAPDH 基因的上下游引物以及PCR 反应体系参考本课题组前期研究[7]。通过HNRNPK mRNA 的相对表达量确定DOX 诱导HepG2 细胞HNRNPK 下调的最适浓度。

1.3.4 Western blot 检测HNRNPK 的表达

接种构建的HepG2 稳转株细胞,通过DOX 诱导HNRNPK 下调,48 h 后收集细胞。通过RIPA 裂解液冰上裂解并提取蛋白,加入5×loading buffer 煮沸制成蛋白样品,进行SDS-PAGE 凝胶电泳。电泳结束后按300 mA 恒流转膜90 min,用含5%脱脂奶粉的TBST 室温封闭1 h 后,用HNRNPK 一抗(1 ∶1000 稀释)4℃孵育过夜。次日,用HRP 标记的二抗(1 ∶10000 稀释)室温孵育1 h,显影检测目的蛋白。

1.3.5 CCK-8 法检测细胞增殖

于96 孔板按3×103个/孔的密度接种稳转株细胞,用DOX 诱导HNRNPK 下调。接种当天取1 组培养上清,加入CCK-8 试剂(1 ∶100 稀释),按照CCK-8 检测试剂盒说明书检测OD450,随后每24 h检测1 次,直至96 h。

1.3.6 细胞克隆形成实验检测细胞增殖

按1×103个/孔的密度将稳转株细胞接种于6孔板。DOX 诱导HNRNPK 下调后,在显微镜下观察克隆大小。待孔中大多数单个克隆中细胞数大于50 时终止实验,用4%多聚甲醛固定细胞,洗涤细胞后用0.1%的结晶紫染色,洗去多余的结晶紫后,在显微镜下观察计算单克隆数并拍照。

1.3.7 划痕实验检测细胞迁移

按2.5×105个/孔的密度将稳转株细胞接种于12 孔板。细胞贴壁后用200 μL 枪头竖直划线。除去孔中漂浮的细胞,用含DOX 与1%胎牛血清的培养基继续培养细胞。在划痕后第48 h 拍照记录细胞迁移状态。

1.3.8 Transwell 实验检测细胞迁移

将稳转株细胞接种于6 孔板,用DOX 诱导HNRNPK 下调。次日,用胰酶消化重悬细胞,并用无血清培养基离心洗涤两次除去血清,随后用含DOX 的无血清培养基重悬并制备细胞悬液。在24孔板(下室)中加入500 μL 含20%胎牛血清的完全培养基,在Transwell 小室(上室)中加入含有DOX的150 μL 细胞悬液。将Transwell 小室浸入24 孔板中,继续诱导培养24 h。除去Transwell 小室中的培养基,PBS 洗涤后用甲醇于室温固定细胞。用PBS 洗去多余的甲醇后,用0.1%的结晶紫染色。最后用ddH2O 洗去多余的结晶紫,并用棉签小心除去Transwell 小室腔内多余的细胞,揭下基底膜固定于载玻片,用中性树脂封片,晾干后在显微镜下观察并计算迁移细胞的数量。

1.3.9 Western blot 检测相关信号通路

检测步骤同1.3.4,通过Western blot 方法检测β-Catenin、c-Myc、c-Jun、MMP7、CCND1、Cyclin-D1等蛋白的表达。

1.4 统计学方法

通过GraphPad Prism V.5.0 软件对实验数据进行统计学分析及t检验,数据以平均数±标准差()表示,以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HNRNPK 沉默不影响HepG2 细胞的形态

实验结果如图1 所示,DOX 诱导HNRNPK 下调后,HepG2 细胞在形态上无明显变化,但与对照病毒组比较,细胞密度稍有不同,可能是增殖能力受到影响,具体差异需进一步实验分析。

图1 HNRNPK 下调的HepG2 细胞形态Figure 1 Cellular morphology of HepG2 cells after HNRNPK downregulation

2.2 HepG2 稳转株中HNRNPK 的表达显著下调

实验结果如图2A 所示,DOX 诱导后HepG2 稳转株中HNRNPK mRNA 显著下调。在DOX 的浓度为5、10 μg/mL 时,HNRNPK 均能下调约60%,且二者之间无显著差异,显示5 μg/mL 是DOX 诱导HNRNPK 下调的最适浓度。进一步检测HNRNPK蛋白水平的表达,如图2B、图2C 所示,用工作浓度为5、10 μg/mL 的DOX 诱导细胞,HNRNPK 表达同样下调。

图2 不同浓度DOX 诱导HNRNPK 下调(n=3)Note.A,qPCR.B,Western blot.C,Relative protein expression of HNRNPK.Compared with the control group,*P＜0.05,***P＜0.001.Figure 2 HNRNPK downregulated by different doses of DOX

2.3 HNRNPK 下调抑制了HepG2 细胞的增殖

实验结果如图3 所示,检测HepG2 细胞的增殖能力,经统计学分析,与对照组比较,HNRNPK 下调的HepG2 细胞增殖能力明显减弱,并且单克隆数量明显减少,表明HNRNPK 下调显著抑制了HepG2细胞的增殖。

图3 HNRNPK 下调抑制HepG2 细胞的增殖(n=3)Note.A,CCK-8 assay.B,Colony formation assay.C,Colony number.Compared with the control group,**P＜0.01,***P＜0.001.Figure 3 HNRNPK downregulation inhibited the proliferation of HepG2 cells

2.4 HNRNPK 下调抑制了HepG2 细胞的迁移

实验结果如图4 所示,通过划痕实验与Transwell 实验检测HepG2 细胞的迁移能力,经统计学分析,HNRNPK 下调的HepG2 细胞的迁移距离明显减小,并且穿过基底膜的细胞数量明显减少,表明HNRNPK 下调显著抑制了HepG2 细胞的迁移。

图4 HNRNPK 下调抑制HepG2 细胞的迁移(n=3)Note.A,Wound healing assay.B,Transwell assay.Compared with the control group,***P＜0.001.Figure 4 HNRNPK downregulation inhibited the migration of HepG2 cells

2.5 HNRNPK 下调对HepG2 细胞增殖与迁移相关的信号通路的抑制

实验结果如图5 所示,检测稳转株细胞中增殖与迁移相关的信号通路的蛋白表达。HNRNPK 下调后,HepG2 细胞中的 Cyclin-D1、CCND1、β-Catenin、c-Myc、c-Jun、MMP7 等蛋白表达均降低。

图5 HNRNPK 下调抑制HepG2 细胞增殖与迁移相关的信号通路(n=3)Note.Compared with the control group,*P＜0.05,***P＜0.001.Figure 5 HNRNPK downregulation inhibited related signaling pathways of proliferation and migration in HepG2 cells

3 讨论

与正常人比较,HNRNPK 在慢性HBV 性肝炎、肝炎后肝硬化及乙肝相关性原发性肝癌患者的血清、尿液中表达上调,表明其与乙肝相关性原发性肝癌具有相关性[8]。并且,HNRNPK 同样在肝癌组织细胞核中表达上调,其表达随着肝癌细胞密度的增加逐渐增强,提示HNRNPK 的高表达可能与肝癌细胞恶性转化和肿瘤发展密切相关[6]。长链非编码 RNA (long non-coding RNAs,lncRNAs) 是HNRNPK 的主要调节因子,二者相互作用能够调控基因的转录与翻译[3]。Qin 等[9]通过研究证实一种名为p53 稳定和激活RNA (p53-stabilizing and activating RNA,PSTAR)的lncRNA 能够通过抑制HNRNPK 的去类泛素化促进p53 信号传导,从而抑制肝癌细胞的增殖。

Zhang 等[10]发 现 lncRNA CASC11 能够与HNRNPK 相互作用激活Wnt/β-Catenin 信号通路,继而促进结直肠癌的生长转移。Liu 等[11]研究证实Wnt/β-Catenin 信号通路能够参与HNRNPK 驱动的头颈鳞癌增殖和迁移抑制过程。Wnt/β-Catenin 通路在肝脏发育、再生和肝癌发生过程中也起着重要作用[12],已有研究显示激活Wnt/β-Catenin 通路能够促进HepG2 细胞的增殖和迁移,因而该通路的激活能够促进肝癌的发展,是肝癌发生的重要分子机制[13]。当Wnt/β-Catenin 信号通路被激活时,包括Cyclin-D1、c-Jun、c-Myc 和基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)在内的下游靶向基因也被异常激活[14]。MMPs 能降解细胞外基质中的各种蛋白成分、生长因子和细胞表面受体,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,从而被认为是肿瘤浸润转移过程中主要的蛋白水解酶[15]。HNRNPK 能够激活Ras-raf-MARK 信号通路,上调在肿瘤转移中起关键性作用的相关基因,如MMP3、MMP10 等[16]。肝癌组织中β-Catenin 的异常表达通常与MMP-7 呈正相关[17]。本实验中,当HNRNPK 下调时,HepG2 细胞中的β-Catenin 表达水平也降低,同时其通路下游的Cyclin-D1、c-Jun、c-Myc、MMP7 表达受到抑制。表明HNRNPK 的下调抑制了Wnt/β-Catenin 通路的激活,因而抑制其下游MMP7 等一系列调控细胞迁移的靶基因表达,最终导致HepG2 细胞的迁移受到抑制。此外,已有研究证实HNRNPK 能够参与细胞周期G0/G1 期与调控Cyclin-D1 开关蛋白2,从而影响膀胱癌细胞增殖和凋亡[18]。原癌基因Cyclin-D1由CCND1 基因所编码,是一种G1/S 期特异性周期蛋白。Cyclin-D1 在多种肿瘤中均被发现基因过表达,过表达的Cyclin-D1 能够导致细胞癌变[19]。本实验中,HNRNPK 的下调抑制了CCND1 与Cyclin-D1 的表达,可能导致细胞周期阻滞,抑制了HepG2细胞的增殖。

本实验构建了由DOX 诱导系统调控HNRNPK稳定下调的HepG2 细胞株,能够实现时间可控性HNRNPK 表达,为进一步研究HNRNPK 对肿瘤形成时间以及肿瘤转移的影响及作用机制提供了更便利的条件与良好的实验基础。当前的研究报导显示,虽然HNRNPK 在多种恶性肿瘤中均显示出异常表达的现象,其在不同肿瘤发生发展中发挥的具体作用却不甚相同[20-22],因此不能单纯地将HNRNPK 划分为癌基因或抑癌基因。HNRNPK 在肿瘤中发挥的具体生物学功能可能与其和不同蛋白、RNA 相互作用从而参与多种信号通路的调控有关。综上所述,HNRNPK 的下调抑制了肝癌细胞HepG2 的增殖与迁移,表明HNRNPK 的异常表达可能促进了肝癌的发展、且对多种肿瘤都有着至关重要的影响,深入研究HNRNPK 的作用机制可能为临床肿瘤治疗和预后提供新的思路。