阿托伐他汀对自身免疫性脑脊髓炎小鼠髓鞘修复及RhoA/Rock1 通路的影响

张沁丽,王玉芬,刘 红,刘博雯

(长治医学院附属和平医院神经内科,山西 长治 046000)

多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是中枢神经系统(central nervous system,CNS)的一种慢性自身免疫性和退行性疾病,其病理改变包括中枢神经系统白质中的多发性脱髓鞘斑块,并伴有反应性胶质增生和轴突损伤[1]。尽管对MS 的病因、发病机制和治疗的研究越来越多,但目前对MS 的治疗方案尚相对有限,MS 仍然是世界范围内的治疗挑战[2]。虽然MS 的病因和机制仍不清楚,但神经炎症被证明在MS 的发生和发展中发挥了关键作用,过度的炎症会导致细胞死亡和组织损伤,如脱髓鞘损伤和轴突损伤[3]。在成人CNS 中,受损神经元轴突再生不良的部分原因是髓鞘相关轴突生长抑制剂的存在,如髓鞘相关糖蛋白、Nogo、少突胶质细胞-髓鞘糖蛋白等,这些抑制剂可以激活RhoA[4]。研究表明RhoA 的激活会导致生长锥的塌陷和轴突生长的抑制,而RhoA 的失活可以促进受损中枢神经系统的轴突再生和功能恢复,RhoA 的下游效应因子是Rho 相关激酶(Rock),包括Rock1 和Rock2,Rock 活化可促进肌球蛋白轻链磷酸酶的磷酸化[5]。因此,我们推测RhoA/Rock 信号通路可能参与自身免疫性脑脊髓炎。他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,广泛用于降低胆固醇,以减少动脉粥样硬化和心血管发病率[6]。最近在自身免疫性疾病动物模型中的研究表明,他汀类药物的抗炎和免疫调节特性可能有益于神经退行性疾病的治疗[7]。目前关于阿托伐他汀在治疗MS 中的作用机制的研究主要集中在免疫调节方面,关于其是否可通过调节髓鞘修复及RhoA/Rock 通路来改善MS 进展的研究尚少。因此,本研究旨在探讨阿托伐他汀对自身免疫性脑脊髓炎小鼠髓鞘修复及RhoA/Rock1 通路的影响,以期为MS 的治疗提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

选用30 只SPF 级C57BL/6 雌性近交系小鼠,6～8 周,18～20 g,购自成都达硕实验动物有限公司[SCXK(川)2020-030],饲养于长治医学院动物实验房[SYXK(晋)2022-0001],饲养条件为室温(24±2)℃的环境中,维持光-暗12 h 循环交替,并予以充足的饲料和洁净饮水。研究方案经长治医学院实验动物伦理委员会批准(IACUC 2019072A),并按照实验动物使用的3R 原则给予人道关怀。

1.1.2 菌株

结核杆菌H37Ra(批号:RNCC263834)购自美国ATCC 公司。

1.2 主要试剂与仪器

阿托伐他汀(批号:20141008)购自辉瑞制药；MOG35-55 购自西安联美生物,纯度＞95%杆菌；百日咳素(PTX,批号:C7897)、完全弗氏佐剂(CFA,批号:F5881)购自美国Sigma 公司；苏木素染液(批号:R20568)、伊红染液(批号:R24044)购yuanye Bio-Technology Co.,Ltd(上海)；IL-6(货号:ZC-36404)、TNF-α(货号:ZC-37624)、NO(货号:ZCS0647)ELISA 试剂盒购自上海茁彩生物；相关一抗NG2(货号:#52635)、MBP(货号:#2396)、RhoA(货号:#2117)、Rock1(货号:# 4035)、生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(货号:#32935)购自CST；RNA TRIzol Reagent(批号:15596026)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(货 号:A44662) 购 自 ThermoFisher SCIENTIFIC(上海)；Western blot 细胞裂解液(货号:P0013)、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(货号:P0009)购自上海碧云天生物；ECL 发光试剂盒(货号:E-IR-R307)、Immobilon-PSQ PVDF 膜(货号:EBC-R266) 购自武汉Elabscience。实时荧光定量(RT-PCR)仪(型号PIKORed 96)和全功能酶标仪MK3 均为美国ThermoFisher 仪器。

1.3 实验方法

1.3.1 自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型制备及分组

将实验小鼠随机分为5 组,空白组、模型组(实验性自身免疫性脑脊髓炎)、阿托伐他汀组、高脂饮食组、高脂饮食+阿托伐他汀组,每组6 只。建模步骤[8]:将抗原MOG35-55 用生理盐水稀释成5 mg/mL,并按1 ∶1 等体积加入CFA,加入结核杆菌H37Ra 使其终浓度为4 mg/mL,充分混合乳化。乳化后按每只0.1 mL 于小鼠脊柱两侧分四点皮下注射,0、48 h 每只小鼠腹腔注射0.5 mL PTX(百日咳毒素500 ng)。空白组以等量生理盐水代替MOG多肽,其余步骤和方法相同。

1.3.2 给药方法

高脂饮食组、高脂饮食+阿托伐他汀组均给予高脂饲料喂养3 周后开始免疫、干预,空白组、模型组、阿托伐他汀组给予普通饲料喂养3 周后开始免疫、干预。阿托伐他汀给药剂量为8 mg/(kg·d),将40 mg 阿托伐他汀溶于125 mL 的0.1 mol/L PBS溶液中形成混悬液,其终浓度为0.32 mg/mL。免疫后第3 天开始应用小鼠灌胃针每只小鼠每天灌服0.5 mL 混悬液,连续28 d。其中,高脂饲料配比为:胆固醇1%、蛋黄粉10%、猪油10%、普通饲料79%。阿托伐他汀给药剂量参考Zeyghami 等[9]的报道。

1.3.3 神经功能评分

采用Knoz 评分法[10]评估小鼠病情变化,连续观察直至动物处死,具体评分标准如下:0 分:无症状；1 分:尾部失去张力；2 分:后肢力弱；3 分:后肢瘫痪；4 分:后肢及前肢瘫痪；5 分:濒临死亡或死亡。

1.3.4 HE 染色和LFB 染色观察

苏木精-伊红(HE)染色:取小鼠脑脊髓,用4%多聚甲醛固定24 h 后,将组织标本放入含30%蔗糖的4%多聚甲醛中保存,脑脊髓组织石蜡包埋,连续切片,厚度5 μm,用HE 染色评价炎性细胞浸润情况。并采用双盲法进行炎细胞浸润评分:0 分,无炎性细胞浸润；1 分,脑膜细胞浸润；2 分,血管周细胞浸润最多4 个小区域；3 分,血管周细胞浸润5 个或5 个以上小区域,和/或1 个以上大型细胞浸润；4 分,大量细胞浸润,累及20%以上的白质。

固蓝(LFB)染色:为了评估脱髓鞘,切片按上述方法处理,并用LFB 染色。将组织切片在60℃的0.1% LFB 溶液中孵育过夜,然后在0.05%的碳酸锂溶液中进行区分,以区分白质和灰质,最后在光学显微镜下观察切片。采用以下评分标准对小鼠的脱髓鞘情况进行双盲法评估:0 分,无髓鞘丢失；1 分,小范围髓鞘丢失；2 分,2 个或3 个小范围髓鞘丢失；3 分,最多2 个大规模髓鞘丢失；4 分,大范围髓鞘丢失,累及超过20%的白质。

1.3.5 ELISA 法检测

按照ELISA 试剂盒说明操作,检测小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的表达。

1.3.6 透射电镜观察

取脑组织,切取胼胝体区域组织,组织块切成1 mm3×1 mm3×3 mm3大小转入2.5%戊二醛固定液中4℃固定24 h。组织块用1%锇酸后固定2 h,然后梯度丙酮脱水,组织块用环氧树脂包被,切取半薄切片1%甲苯胺蓝染色后,超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色,在透射电镜下观察中枢神经系统胼胝体区髓鞘超微结构改变。

1.3.7 免疫组织化学染色观察

脑脊髓组织切片脱蜡复水,用3% H2O2室温孵育30 min,加正常山羊血清后37℃孵育30 min,滴加一抗(NG2、MBP(1 ∶300))37℃孵育1 h。用山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(1 ∶200)室温孵育2 h。用DAB 试剂显示阳性细胞,苏木精复染、酒精盐酸分化、脱水、中性树胶封片,显微镜观察,用Image Pro Plus 6.0 软件对NG2、MBP 进行定量分析。

1.3.8 qRT-PCR 检测

根据制造商的说明,采用TRIzol 试剂从脑组织或脊髓组织中提取总RNA,然后对RNA 进行量化,将一定量的RNA 逆转录成cDNA。随后使用TaKaRa TB GreenTMPreMix Ex TaqTM的聚合酶链式反应对基因表达水平进行定量,用2-ΔΔCT方法计算基因表达水平,并用内源性参考GAPDH 值进行归一化。本研究中使用的引物序列如表1 所示。qRT-PCR 反应条件为预变性95℃30 s,变性95℃5 s,退火55℃30 s,延伸72℃30 s,45 个循环,记录CT 值。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3.9 Western blot 分析

脑组织用冷PBS 洗涤2 次,用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液从脑组织提取蛋白质,冰上孵育,裂解产物在12000 r/min 下离心15 min,收集上清液,并通过BCA 蛋白检测试剂盒分析蛋白浓度。然后,将上清液与12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶样品加载缓冲液混合,并转移到PVDF 膜(微孔)上,根据制造商的说明,转移的印迹与封闭剂(5%脱脂牛奶在Tris 缓冲盐水中)室温封闭2 h 后,将膜与抗RhoA(1 ∶500)、Rock1(1 ∶500)或β-actin(1 ∶2500)的抗体在4 抗下一起孵育过夜。然后,在摇床上用TBST 缓冲液(含0.1%Tween 20 的Tris 缓冲液,pH=7.6)和生物素化山羊抗兔IgG 抗体孵育2 h。使用增强型化学荧光检测试剂盒(ECL)进行显影,使用化学发光成像仪检测化学发光膜的免疫反应性,并通过使用Image-ProPlus 分析光密度,以β-actin 为内参,对蛋白进行量化,实验重复3 次。

1.4 统计学方法

使用SPSS 22.0 软件(IBM Corp.)对数据进行统计分析,数据表示为平均数±标准差(),采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间比较分析,方差齐性时用LSD 检验,方差不齐时用Tamhane’sT2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 阿托伐他汀对自身免疫性脑脊髓炎小鼠神经功能评分的影响

与空白组比较,模型组小鼠神经功能评分于给药前、给药15 d、给药28 d 时均明显升高(P＜0.01),与模型组比较,阿托伐他汀组和高脂饮食+阿托伐他汀组于给药15 d 和给药28 d 明显降低神经功能评分,且28 d 时降低更明显(P＜0.05),见表2。

表2 各组小鼠神经功能评分Table 2 Neurological function scores of mice in each group

2.2 阿托伐他汀对自身免疫性脑脊髓炎小鼠炎性脑浸润和脊髓脱髓鞘的影响

空白组:未见明显炎性细胞浸润(炎细胞浸润评分为0 分)及未发生脱髓鞘改变(脱髓鞘评分0分)。模型组:小鼠脑组织白质区神经纤维束间见较多炎性细胞浸润,以核呈圆形深染的淋巴细胞为主,部分炎性细胞围绕在血管周围；脊髓组织LFB染色可见髓鞘蓝染区域的面积显著减少,可见大面积髓鞘脱失后着色为白色的区域,即发生明显脱髓鞘改变。阿托伐他汀组和高脂饮食组:小鼠脑组织白质区神经纤维束间见极少量炎性细胞浸润,以及少量小胶质细胞增生；脱髓鞘程度较模型组好转。高脂饮食+阿托伐他汀组:小鼠脑组织白质区神经纤维束间见少量淋巴细胞浸润,少量小胶质细胞增生；脱髓鞘程度较模型组好转。进一步量化分析,与模型组比较,阿托伐他汀组、高脂饮食+阿托伐他汀组小鼠炎细胞浸润评分及脱髓鞘评分明显降低(P＜0.01)(图1)。

图1 小鼠炎性脑浸润和脊髓脱髓鞘变化Note.A,HE staining and quantitative analysis.B,LFB staining and quantitative analysis.Compared with control group,**P＜0.01.Compared with model group,##P＜0.01.Figure 1 Changes of inflammatory brain infiltration and spinal cord demyelination in mice

2.3 阿托伐他汀对自身免疫性脑脊髓炎小鼠炎性细胞因子的影响

与空白组比较,模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量明显升高(P＜0.01),与模型组比较,阿托伐他汀可明显降低小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO的含量(P＜0.05),见表3。

表3 各组小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量Table 3 Contents of TNF-α,IL-6 and NO in serum of mice in each group

2.4 阿托伐他汀对自身免疫性脑脊髓炎小鼠髓鞘再生修复的影响

透射电镜观察结果显示,空白组小鼠的轴突间距、髓鞘板层结构正常。模型组髓鞘呈松散的层状结构,排列极为松散,部分髓鞘崩解、断裂、脱失,轴索萎缩变性,结构不清晰。阿托伐他汀组和高脂饮食+阿托伐他汀组可见髓鞘排列松散,少量髓鞘崩解脱失及轴索萎缩,结构尚清晰。高脂饮食组髓鞘呈松散的层状结构,结构不清晰(图2A)。免疫组化检测结果显示,模型组较空白组NG2、MBP 表达明显降低(P＜0.01),与模型组比较,阿托伐他汀组NG2、MBP 表达明显升高(P＜0.01)(图2B～2E)。qRT-PCR 检测表明,与空白组比较,模型组MBP、NG2 mRNA 表达明显降低(P＜0.01),与模型组比较,阿托伐他汀可明显升高MBP、NG2 mRNA 表达(P＜0.05)(图2F)。

图2 各组小鼠髓鞘再生修复情况Note.A,Transmission electron microscope observation.B,MBP immunohistochemical staining.C,NG2 immunohistochemical staining.D,MBP average optical density.E,NG2 average optical density.F,MBP and NG2 mRNA expression.Compared with control group,**P＜0.01.Compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01.Figure 2 Remyelination and repair of mice in each group

2.5 阿托伐他汀对自身免疫性脑脊髓炎小鼠RhoA/ROCK-1 通路的影响

与空白组比较,模型组小鼠脑组织RhoA、Rock1 mRNA 和蛋白表达均明显升高(P＜0.01),与模型组比较,仅阿托伐他汀可明显降低小鼠脑组织RhoA、Rock1 mRNA 和蛋白表达(P＜0.05),见图3。

图3 各组小鼠RhoA/ROCK-1 通路相关因子的表达Note.A,RhoA and Rock1 mRNA expression.B,RhoA and Rock1 protein expression bands.C,RhoA and Rock1 protein expression.Compared with control group,**P＜0.01.Compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01.Figure 3 Expression of RhoA/ROCK-1 pathway related factors in each group of mice

3 讨论

MS 是一种以自身免疫性炎症、脱髓鞘和轴突损伤为特征的中枢神经系统慢性疾病[11]。文献[12]显示脂质代谢和炎症途径在许多点相互交叉调节,并通过局部机制参与调节中枢神经系统的神经功能。不仅如此,Mandoj 等[13]认为与胆固醇异常稳态相关的血栓形成和神经退行性机制可能有助于MS 进展。Tettey 等[14]进行的一项前瞻性队列研究亦表明高胆固醇水平对于MS 患者产生不利影响,与残疾及疾病的进展相关。故高脂与MS 之间存在一定联系。阿托伐他汀作为临床常用的降血脂药物,其安全性已经得到肯定,但目前关于其是否可改善MS 髓鞘修复及是否可通过调节降脂水平来改善MS 的研究尚少。EAE 可较好的模拟MS 临床表现及病理特征,由此,本研究选用MOG35-55 多肽片段诱导EAE 小鼠模型作为研究对象,设置阿托伐他汀组的同时设置高脂饮食组、高脂饮食+阿托伐他汀组,观察其对髓鞘再生修复情况及对RhoA/Rock-1 通路的影响,为他汀在MS 治疗中的应用提供更多依据,为MS 的治疗提供更多契机。

神经炎症是中枢神经系统最基本的保护性反应之一,在许多生理和病理过程中发挥着至关重要的作用[15]。大脑和脊髓作为一种自我防御机制,可以对损伤产生免疫反应,这些反应包括消除侵袭性病原体,清除受损细胞,促进组织修复[16]。然而,神经炎症过程是一把双刃剑,在不平衡的条件下,可能导致不同程度的组织损伤和功能障碍[17]。过度的神经炎性反应已被认为是MS 的病因之一,控制炎症是该病早期的主要治疗目标[18]。在EAE 模型小鼠连续给予阿托伐他汀、高脂饮食+阿托伐他汀后,我们观察到与未治疗的小鼠相比,神经学评分被明显改善,而高脂饮食组小鼠神经学评分未见明显变化。此外,脑部炎症浸润以及脊髓脱髓鞘程度也有所减轻。EAE 模型小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量明显高于空白组,阿托伐他汀可明显降低EAE 模型小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量,高脂饮食+阿托伐他汀干预后EAE 模型小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO 的含量无明显变化,但有降低趋势。在正常的中枢神经系统条件下,NO 调节多种生理过程,如血流、免疫反应和突触传递。然而,越来越多的证据表明iNOS 诱导的高NO 水平与MS的许多病理表现有关[19]。同样,本实验证实EAE模型小鼠的NO 含量明显升高。根据阿托伐他汀缓解EAE 症状的功能,阿托伐他汀可下调NO 的产生,高脂饮食+阿托伐他汀组可下调NO 的水平,但无明显改善。因此,中枢神经系统抗炎能力的明显提高可能归因于阿托伐他汀的神经保护作用,饲喂高脂饲料的EAE 小鼠给予阿托伐他汀后TNF-α、IL-6、NO 含量较EAE 模型小鼠有降低趋势,提示阿托伐他汀可能通过降脂改善MS 病理学特征和促炎因子的表达等。

髓鞘修复被认为是MS 功能恢复的关键,然而,脱髓鞘给轴突带来了巨大的新陈代谢负担,造成不可逆的损害,导致MS 的永久性神经缺陷[20]。MS的脱髓鞘病变是由神经炎症和自身免疫机制引起的,然而,中枢神经系统可以在脱髓鞘事件后再生,特别是在MS 的初期。但随着脱髓鞘攻击次数的增加和时间的延长,再髓鞘形成的效果似乎降低,并导致具有神经症状的损伤[21]。研究已表明IFN-γ诱导的炎症和少突胶质细胞死亡被认为是MS 病变髓鞘再生不良的主要因素[22]。EAE 中过多的IL-1β 产生会杀死神经元和少突胶质细胞,但也会通过诱导胰岛素样生长因子1(IGF-1)的产生来促进髓鞘再生[23]。此外TNF-α、IL-6 在EAE 小鼠的脱髓鞘免疫炎症病变中驱动脱髓鞘[24]。由此,探讨髓鞘修复对于开发抗MS 进展的恢复性疗法至关重要。NG2 是一种表达在少突胶质前体细胞膜上的糖蛋白,可作为少突胶质前体细胞的特异性细胞标志物[25]。MBP 是一种具有黏附作用并在髓鞘的形成中起到关键作用的一个重要的髓鞘组成成分[26],在少突胶质前体细胞分化过程中,有丝分裂后期的少突胶质细胞成熟阶段,髓鞘抗原MBP 被合成,并在髓鞘外缘形成稳定膜状板层结构,从而保证了髓鞘的完整性[27]。RhoA/ROCK-1 信号通路是体内普遍存在的信号转导通路,参与细胞的形态发生、粘附、迁移和增殖等多种生物学过程[28]。在成人中枢神经系统中,受损神经元轴突再生不良的部分原因是髓鞘相关轴突生长抑制剂的存在,如髓鞘相关糖蛋白、Nogo、少突胶质细胞-髓鞘糖蛋白等,这些抑制剂可以激活RhoA[4]。激活的RhoA 会导致生长锥塌陷和轴突生长抑制,而RhoA 的失活可以促进受损中枢神经系统的轴突再生和功能恢复,RhoA 的下游效应因子Rock 活化可促进肌球蛋白轻链磷酸酶的磷酸化[5]。本研究结果显示,阿托伐他汀组和高脂饮食+阿托伐他汀组可见髓鞘排列松散,少量髓鞘崩解脱失,少量轴索萎缩,结构尚清晰；模型组小鼠较空白组NG2、MBP 蛋白及mRNA 表达明显降低,阿托伐他汀可明显升高小鼠MBP、NG2 蛋白及mRNA 表达；且模型组小鼠脑组织RhoA、Rock1 蛋白和mRNA 表达均较空白组明显升高,仅阿托伐他汀可明显降低小鼠脑组织RhoA、Rock1 蛋白和mRNA 表达。揭示阿托伐他汀在自身免疫性脱髓鞘疾病中的有效保护作用,可能通过降脂改善MS 髓鞘崩解。

综上所述,阿托伐他汀明显缓解了EAE 疾病的进展,促进了EAE 髓鞘修复,抑制炎症因子的产生,并有降低高脂饮食EAE 小鼠神经功能评分及髓鞘崩解的作用,是潜在的治疗MS 的药物,具有新的作用机制,RhoA/Rock-1 可能是治疗MS 的一个有前途的治疗靶点。