和厚朴酚通过Notch 信号通路抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠免疫失衡并提供肺保护作用

李 彬,甘德堃,王璐璐

(河南省中医院肺病科,郑州 450002)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以不完全可逆的气流受限为特征的肺部疾病[1-2]。最近的研究发现,COPD 患者存在T 细胞亚群失衡的免疫紊乱。T 细胞亚群执行以Th1 和Th17 为主的获得性免疫反应,这种免疫反应可导致COPD 慢性炎症的持续和扩大,加速气道重塑,这与COPD 的发病机制和病情加重有关[3]。杨鑫娜等[4]报道,Notch 信号通路可调节COPD 患者Th1/Th2 和Th17/Treg 的免疫失衡,参与COPD 的发病机制。和厚朴酚(honokiol,HNK,C18H18O2)是从厚朴或凹叶厚朴树皮中提取的一种双酚类化合物,在中国和日本的传统医药中有广泛的应用,多用于治疗血栓性中风、治疗焦虑和胃肠道症状,并且还具有心脏保护作用、抗微生物作用、抗炎作用、抗炎作用、抗血管生成作用和抗血管生成作用[5-7]。最近的研究报道和厚朴酚能显著抑制哮喘小鼠嗜酸性粒细胞浸润,减轻气道炎症,抑制炎性细胞因子的产生,这些结果提示和厚朴酚可能是治疗肺哮喘相关疾病的候选药物[8]。然而,目前尚无文献报道和厚朴酚在COPD 中的应用效果。因此,本研究旨在揭示和厚朴酚是否可改善COPD 小鼠免疫平衡并提供肺保护作用,并进一步探讨Notch 信号通路是否介导和厚朴酚对COPD 的治疗机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

30 只6～8 周龄无特定病原体(SPF)雄性BALB/c 小鼠购自凯学生物科技(上海)有限公司[SCXK(沪)2020-0005],平均体重(20±2)g。所有小鼠于温度(22±1)℃、湿度(50±5)%、光照/黑暗周期12 h/12 h 的SPF 级实验室内饲养,饲养室位于河南中医药大学实验动物中心[SYXK(豫)2020-0004],不限制食物和水。本研究由河南省中医院动物实验伦理委员会批准(IACUC:20200013),实验研究过程中做到了3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器

和厚朴酚(货号SND-287)购自滁州仕诺达生物科技有限公司；香烟购自河南安阳卷烟厂；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(货号C0105M)购自碧云天生物技术研究所；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD3 抗体(货号LM-10498R-FITC)购自上海联迈生物工程有限公司；RPMI-1640(货号PM150110A)购自上海雅吉生物科技有限公司；藻红蛋白-花青苷5(PE/CY5)标记的CD4 抗体(货号100409)、藻红蛋白(PE)标记的IL-4(货号504103)、FITC 标记的IFN-γ(货号505805)、PE 标记的Foxp3 (货号364703)和FITC 标记的IL-17A(货号512303)购自美国Bio Legend 公司；Notch 1(货号ab52627)、Notch 2(货号ab245325)、Notch 3(货号ab23426)、Notch 4(货号ab184742)、Hes1(货号ab119776)、Hes5(货号ab194111)、Hey1(货号ab154077)和βactin(货号ab8227)一抗购自英国Abcam 公司；辣根过氧化物酶偶联IgG 二抗(货号ZB-2306)购自北京中杉金桥生物科技有限公司；IFN-γ (货号439007)、IL-4(货号EA-2510)、IL-17(货号HIL-17A-175)和IL-10(货号EA-2513)ELISA 试剂盒购自深圳市达科为生物技术股份有限公司。

GYD-003 型动物肺功能测试系统购自法国EMKA 公司；CytoFLEX 流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；BP121S 电子天平购自德国赛多利斯公司；动物恒温系统ALC-HTP 购自上海奥尔科特生物科技有限公司；Nanodrop 2000 紫外分光光度计、MK3 酶标仪购自美国Thermo 公司；Mini P-4 垂直电泳槽、电泳仪、电转仪购自美国Bio-Rad 公司；Western blot 显影仪购自德国QUANTUM 公司；Leica RM2235 石蜡切片机购自德国Leica 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 COPD 模型制备

将小鼠随机分为3 组:正常对照组(Normal)、COPD 组和COPD+HNK 组,每组10 只。将COPD组和COPD+HNK 组小鼠置于50 cm、30 cm、35 cm的有机玻璃盒子进行香烟烟雾诱导(焦油量:14 mg,烟气烟碱量:1.1 mg),每天吸烟4 次(4 支,45 min),间隔1 h,连续90 d。从造模第61 天开始,COPD+HNK 组隔日腹腔注射和厚朴酚(HNK,10.00 mg/kg),至第90 天。和厚朴酚的使用剂量参考文献[9-10]进行设置,前人文献中和厚朴酚的使用剂量为2～16 mg/kg,因此本文将的剂量设置为10.00 mg/kg。

1.3.2 肺功能测试

治疗完成后,采用法国EMKA GYD-003 型动物肺功能测试系统检测吸气峰流速(PIF)和呼气峰流速(PEF)。

1.3.3 肺组织病理形态学观察

治疗完成后,采用颈椎脱位法处死小鼠。取小鼠肺组织,置于10%多聚甲醛溶液中固定。石蜡包埋,切片,然后进行苏木精-伊红(HE)染色,检测方法严格按照制造商说明书进行。

1.3.4 小鼠脾T 细胞分离

在无菌条件下,取小鼠脾,研磨后在200 目滤网上滤过,制成单细胞悬液,缓慢加入小鼠淋巴细胞分离液中,以2500 r/min 离心20 min。吸取中间层淋巴细胞,调整细胞数至每毫升1×106个,加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD3 抗体,流式细胞仪检测总T 细胞(CD3+T)纯度。

1.3.5 CD4+T 细胞亚群检测

使用RPMI-1640 调整脾T 淋巴细胞浓度为每毫升1×106个,细胞中加入藻红蛋白-花青苷5(PE/CY5)标记的CD4 抗体。然后,用4%多聚甲醛固定细胞。分别加入膜裂解剂、藻红蛋白(PE)标记的IL-4、FITC 标记的IFN-γ、PE 标记的Foxp3 和FITC 标记的IL-17A。用流式细胞仪检测Th1、Th2、Th17 和Treg 的表达,计算Th1/Th2 和Th17/Treg 亚群的比值。

1.3.6 Western blot

提取小鼠T 淋巴细胞总蛋白,用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离50 μg 蛋白样品。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,室温下用5%脱脂牛奶封闭膜30 min。然后将膜与Notch 1/2/3/4(1 ∶500 稀释)、Hes1(1 ∶1000 稀释)、Hes5(1 ∶500 稀释)、Hey1(1 ∶2000 稀释)和β-actin(1 ∶1000 稀释)4℃孵育过夜。然后将膜与辣根过氧化物酶偶联IgG 二抗(1 ∶2000 稀释)在室温下孵育2 h,ECL 显影。β-actin 作为内参蛋白,将目标蛋白的灰度值标准化为β-actin 的灰度值。

1.3.7 血清IFN-γ、IL-4、IL-17 和IL-10 水平检测

采集小鼠静脉血,分离血清。采用ELISA 法严格按照试剂盒说明书检测小鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17 和IL-10 水平。

1.4 统计学方法

所有实验数据用SPSS 17.0 统计软件进行分析。每组数据均以平均数±标准差()表示。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。多重比较采用最低显著性差法(LSD-t)。P＜0.05 说明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 和厚朴酚对COPD 小鼠肺组织病理变化的影响

通过HE 染色评价各组小鼠肺组织病理变化(图1)。Normal 组小鼠肺组织结构基本完整,未见明显病理改变。COPD 组小鼠肺泡间隔内可见炎性细胞浸润,终末细支气管远端气腔膨胀,间隙变窄,肺泡数明显减少,肺泡腔扩张,肺泡壁破裂,符合COPD 的病理学表现。COPD+HNK 组小鼠肺组织病变较COPD 组减轻,炎性细胞浸润减少,肺泡数增多,肺泡腔缩小。

图1 各组小鼠肺组织的HE 染色Figure 1 HE staining of lung tissue of mice in each group

2.2 和厚朴酚对COPD 小鼠肺功能的影响

HE 染色结果显示,小鼠肺组织形态符合COPD的病理学表现,表明建模成功。通过吸气峰流速(PIF)和呼气峰流速(PEF)评价各组小鼠肺功能,如图2 所示,与Normal 组相比,COPD 组小鼠的PIF和PEF 均显著降低(P＜0.05)。与COPD 组相比,COPD+HNK 组小鼠的PIF 和PEF 均显著升高(P＜0.05)。说明和厚朴酚能改善COPD 模型小鼠的肺功能。

图2 和厚朴酚对COPD 小鼠肺功能的影响Note.A,Peak inspiratory flow(PIF).B,Peak expiratory flow(PEF).Compared with normal group,*P＜0.05.Compared with COPD group,#P＜0.05.Figure 2 Effect of honokiol on the lung function of COPD mice

2.3 和厚朴酚对COPD 小鼠T 细胞亚群的影响

各组小鼠T 细胞亚群分布如图3 所示,与Normal 组相比,COPD 组小鼠的Th1 百分比、Th1/Th2 比值、Th17 百分比和Th17/Treg 比值均显著升高(P＜0.05),而Treg 百分比和Th2 百分比无显著变化(P＞0.05)。与COPD 组相比,COPD+HNK 组小鼠的Th1 百分比、Th1/Th2 比值、Th17 百分比和Th17/Treg 比值均显著降低(P＜0.05)。这些结果说明和厚朴酚可改善COPD 小鼠T 细胞亚群。

图3 和厚朴酚对COPD 小鼠T 细胞亚群的影响Note.A,Mouse spleen Th1 percentage.B,Th2 percentage.C,Th1/Th2 ratio.D,Th17 percentage.E,Treg percentage.F,Th17/Treg ratio.Compared with normal group,*P＜0.05.Compared with COPD group,#P＜0.05.Figure 3 Effect of honokiol on T cell subsets in COPD mice

2.4 和厚朴酚对COPD 小鼠T 细胞Notch 信号通路的影响

通过Western blot 检测各组小鼠脾T 细胞中Notch 信号通路的蛋白表达(图4),结果显示,与Normal 组相比,COPD 组小鼠脾T 细胞中的Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hes5、Hey1的蛋白相对表达量均显著升高(P＜0.05)。与COPD 组相比,COPD+HNK 组小鼠脾T 细胞中的Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hes5、Hey1的蛋白相对表达量均显著降低(P＜0.05)。这些结果说明和厚朴酚抑制了COPD 小鼠T 细胞中的Notch 信号通路。

图4 和厚朴酚对COPD 小鼠T 细胞Notch 信号通路的影响Note.A～G,Relative expression of Notch1,Notch2,Notch3,Notch4,Hes1,Hes5,Hey1 in mouse spleen T cells in sequence.H,Western blot representative band.Compared with normal group,*P＜0.05.Compared with COPD group,#P＜0.05.Figure 4 Effect of honokiol on the Notch signaling pathway of T cells in COPD mice

2.5 和厚朴酚对COPD 小鼠血清细胞因子的影响

通过ELISA 法检测各组小鼠血清细胞因子水平(图5),结果显示,与Normal 组相比,COPD 组小鼠血清中的IFN-γ 和IL-17 水平均显著升高(P＜0.05),而IL-4 和IL-10 水平显著降低(P＜0.05)。与COPD 组相比,COPD+HNK 组小鼠血清中的IFNγ 和IL-17 水平均显著降低(P＜0.05),而IL-4 和IL-10 水平显著升高(P＜0.05)。说明和厚朴酚影响了COPD 小鼠血清细胞因子的分泌。

图5 和厚朴酚对COPD 小鼠血清细胞因子的影响Note.A～D,Levels of mouse serum IFN-γ,IL-4,IL-17 and IL-10 in sequence.Compared with normal group,*P＜0.05.Compared with COPD group,#P＜0.05.Figure 5 Effect of honokiol on serum cytokines in COPD mice

3 讨论

和厚朴酚最初是从厚朴或凹叶厚朴树皮中提取的具有抗衰老、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等作用的一种双酚类化合物。据报道,和厚朴酚通过激活Akt 介导的胆碱能神经元存活通路改善快速老化SAMP8 小鼠衰老相关的学习和记忆损伤[11]。和厚朴酚通过减少ROS 的产生而减轻大鼠脑缺血再灌注损伤[12]。在肾缺血/再灌注损伤(I/RI)模型中,与I/R 组相比,和厚朴酚预处理降低炎性标志物如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的表达水平[13]。此外,和厚朴酚在多种癌细胞中显示出强大的抗肿瘤活性[14-15]。本研究中,和厚朴酚显著升高COPD 小鼠的PIF 和PEF,并且HE 染色也显示和厚朴酚减轻了香烟烟雾诱导的肺组织病理变化,说明和厚朴酚能改善COPD 模型小鼠的肺功能。其他学者报道和厚朴酚对哮喘也具有良好的治疗作用[8],因此,和厚朴酚在治疗肺部疾病方面可能具有较高的潜力。

T 淋巴细胞介导的过度免疫反应在COPD 的发生和发展中起着重要作用,并且这些细胞的数量随着气流限制的增加和肺气肿的加重而增加[16]。T淋巴细胞可以分化为Th1 或Th2 细胞,具体取决于它们产生的细胞因子类型。目前,许多研究发现COPD 存在Th1 介导的免疫应答,表现为IFN-γ(Th1 细胞因子)水平升高,IL-4(Th2 细胞因子)水平降低,Th1/Th2 失衡[17]。另外,IL-17/Treg 的平衡是维持免疫系统稳定和避免过度免疫反应的重要因素。最近的研究发现COPD 患者也存在Th17/Treg 失衡,表现为IL-17(Th17 细胞因子)分泌增加,IL-10(Treg 细胞因子)分泌减少[18]。本研究中,和厚朴酚显著降低了COPD 小鼠的Th1 百分比、Th1/Th2 比值、Th17 百分比和Th17/Treg 比值,显著降低IFN-γ 和IL-17 水平,而升高IL-4 和IL-10 水平,纠正了Th1/Th2 和Th17/Treg 细胞失衡。Th1 细胞主要分泌IL-2、IFN-γ 和TNF-α[19]。Th2 细胞主要分泌IL-4,刺激B 淋巴细胞增殖产生IgG 和IgE,并介导体液免疫[20]。此外,高水平的IL-4 可通过激活自然杀伤T 细胞[21]。大量的文献均证实,Th2 细胞分泌的细胞因子在减轻炎症方面发挥着重要作用。结合本研究结果可知,和厚朴酚可使COPD 小鼠体内Th1 细胞向Th2 细胞漂移,从而抑制了Th1/Th2细胞失衡引起的过度炎症反应。IL-17 是中性粒细胞炎症的关键启动子。既往研究报道COPD 患者IL17 水平升高,这可能导致中性粒细胞募集和浸润到炎症部位,最终通过刺激肺微血管内皮细胞产生CXCL8(IL-8)、E-选择素、血管细胞粘附分子-1 和细胞间粘附分子-1,从而加重COPD[22]。IL-17 可诱导急性炎症、募集Th17 细胞并激活Th1 细胞以促进细胞免疫反应。IL-10 是B 淋巴细胞的经典刺激物,它通过抑制核因子κB(一种关键的炎症转录因子)的表达来抑制Th1 细胞产生TNF-α、IL-2 和IFN-γ[23]。因此,抑制IL-17 的表达并增加IL-10 的表达可通过多种途径来抑制炎症。本研究结果说明,和厚朴酚抑制了COPD 小鼠IL-17 的表达并增加IL-10 的表达,从而使Th17 细胞向Treg 细胞漂移,进而抑制了Th17/Treg 细胞失衡引起的过度炎症反应。另外,Wang 等[24]发现COPD 患者Th17 和调节性T 细胞(Treg)失衡,血清IL-6 和IL-17 水平升高,与用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼气量(FEV1)、FEV1/FVC 值降低密切相关,这些变化与COPD 患者病情严重程度相关。总之,和厚朴酚通过纠正Th1/Th2 和Th17/Treg 细胞失衡,进而改善了COPD 小鼠的肺功能。

Notch 信号通路是一个高度保守的信号转导通路,包括4 个同源受体Notch1/2/3/4 和5 个配体Delta1/3/4 和Jagged1/2,它们表达在T 细胞和多个成熟免疫细胞表面,参与T 细胞的分化[25]。在Notch 受体与配体结合后,下游的靶基因被激活以抑制分化调节因子的表达,最终影响细胞的分化、增殖和凋亡[26]。Laky 等[27]发现抗原提呈细胞表面的Delta 样4(DLL4)与CD4/T 细胞表面的Notch 受体结合,增加IL-2 的分泌,调节适应性免疫反应。Notch1 受体的激活可以调节Th17 细胞分化[28]。杨鑫娜等[4]报道,Notch 信号通路可调节COPD 患者Th1/Th2 和Th17/Treg 的免疫失衡,参与COPD 的发病机制。Notch 配体DLL1 和DLL4 可以诱导Th1细胞分化,抑制Th2 细胞分化,促进CD4+T 细胞分泌IFN-γ,并下调IL-4 和IL-13 水平[25]。在CD4+T细胞的早期激活过程中,Notch 受体已经被激活,并且可以启动Th17 细胞中的基因转录[29]。抑制Notch 信号可以降低外周血中Th17 细胞的百分比,导致Th17/Treg 比值降低,进而减弱Th17 细胞介导的免疫应答,增强Treg 细胞的免疫抑制功能[30]。另外,Notch 受体通过细胞间相互作用和配体结合,以及通过γ-分泌酶的酶解激活下游靶基因Hes 和Hey 家族,这两个基因共同参与了T 细胞的激活、增殖和分化。本研究中,Notch 信号通路在COPD 小鼠体内被激活,这是Th1 和Th17 介导的促炎性免疫紊乱的主要原因。然而,和厚朴酚显著降低了COPD 小鼠脾T 细胞中的Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hes5、Hey1 的蛋白表达。结果表明,和厚朴酚通过抑制T 细胞Notch 信号通路的激活降低了COPD 小鼠Th1/Th2 和Th17/Treg 的比例,从而减少血清IFN-γ 和IL-17 的分泌,并促进IL-4 和IL-10 的分泌。

综上所述,本研究表明香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型存在Th1/Th2 和Th17/Treg 细胞失衡。而和厚朴酚通过抑制COPD 小鼠脾T 细胞Notch 信号通路的激活,进而纠正了COPD 小鼠Th1/Th2 和Th17/Treg 细胞的失衡,从而改善了肺功能。