75株蛋鸡源沙门菌的MLST分型与耐药性分析

王 喜，李 珂，李廷翠，严红亚，赵 蓉，常志顺，廖 明，孙敏华*，信爱国*

(1.云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所，昆明 650224；2.云南农业大学动物医学院，昆明 650201；3.广东省农业科学院动物卫生研究所，广州 510642)

沙门菌()为肠杆菌科沙门菌属的革兰阴性杆状菌，广泛分布于自然界，血清型众多，迄今已鉴定出2 600多种，宿主谱较广，包括人类在内的所有哺乳动物、鸟类和冷血动物，是重要的人畜共患病原体。各血清型沙门菌均有致病性，一旦养殖场沙门菌病暴发，将会给食品安全、公共卫生以及养殖业带来严重后果，严重威胁人类健康和经济发展，并且随着抗生素在畜禽养殖业生产中的广泛使用，在抗生素的压力下，沙门菌已诱发出多种耐药机制。目前，围绕云南蛋鸡源沙门菌的耐药性、毒力基因等基本流行情况的报道较少，本研究对2017年7月至2019年5月间来自云南部分养殖场的发病鸡进行沙门菌的分离鉴定、多位点序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)、耐药性以及毒力基因携带情况检测分析，以期掌握云南蛋鸡源沙门菌病的基本流行病学情况，为云南地区鸡源沙门菌的防控以及净化工作提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源与质控菌株

用于细菌分离的病料为2017年至2019年间分离自云南昆明、大理、开远、玉溪、石林、盐津6个地区8个养殖场的142只发病蛋鸡肝组织。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922购自中国微生物菌种保藏中心，肠炎沙门菌BNCC 103307购自北纳创联生物科技公司。

1.2 主要试剂

SS培养基、麦康凯培养基等购自广东环凯微生物科技有限公司；沙门菌属诊断血清60种购自宁波天润生物药业有限公司。

1.3 沙门菌分离鉴定

无菌挑取病鸡肝组织，划线接种于麦康凯琼脂培养后，挑取沙门菌疑似菌落转接于SS琼脂，并进行革兰染色镜检、生化鉴定。参照Tarabees等建立的方法合成沙门菌属特异性基因A的引物，PCR扩增鉴定后使用沙门菌属诊断血清进行血清型鉴定。引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，测序均由昆明硕擎生物有限公司完成。

1.4 沙门菌分离株MLST分型

依据MLST官方网站合成沙门菌MLST 分型的7 个管家基因C、A、E、N、A、D和D引物，扩增测序后用DNAstar修正，上传到MLST 网站获取等位基因编号，进而确定每个菌株的ST 型别。

1.5 沙门菌分离株药物敏感性检测

选取15种临床常用抗菌药采用K-B纸片扩散法进行药物敏感性试验，以大肠埃希菌ATCC 25922作为质控菌。参照Chuanchuen等的方法选取β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、四环素类和喹诺酮类部分耐药基因对分离株进行检测。

1.6 沙门菌分离株毒力基因检测

依据Tarabees等的研究合成9对沙门菌毒力岛、毒力质粒和毒素相关毒力基因引物。

2 结 果

2.1 沙门菌分离鉴定

2.1.1 发病鸡临床症状及剖检情况 发病蛋鸡精神倦怠，被毛松乱，食欲不振，排白色或绿色稀粪。剖检可见肝明显肿大，呈土黄色或黄褐色，少部分呈铜绿色，且大部分有出血点、出血斑，同时可见灰白色点状或不规则条纹状、斑块状坏死灶，个别鸡只脾肿大，临床初步判断为沙门菌感染所致。

2.1.2 分离鉴定结果 细菌培养形态、革兰染色镜检、生化鉴定试验结果均符合沙门菌特性，从142只病鸡肝组织样品中共分离到疑似沙门菌属菌株75株。

2.2 分离菌PCR鉴定结果

75株分离菌株均能扩增出A基因，表明这75株菌均为沙门菌，发病鸡只肝组织样品沙门菌平均分离率为52.8%。

2.3 沙门菌分离株血清型鉴定结果

血清型鉴定结果表明，75株沙门菌均属于D群鸡-雏沙门菌。鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌O抗原相同，且均无H抗原，因此采用MLST分型方法对两种血清型菌株作进一步分型鉴定。

2.4 沙门菌分离株MLST分型鉴定结果

分离菌株均能扩增出7个管家基因(图1)，产物测序后上传MLST网站，所有菌株都得到相应的MLST型别，产生2种ST序列型，包括ST92序列型鸡白痢沙门菌21株，占总分离数28.0%(21/75)；ST78序列型鸡伤寒沙门菌54株，占比72.0%(54/75)，表明目前云南地区蛋鸡源沙门菌优势流行株为鸡伤寒沙门菌。

M.DL 2000 DNA Marker；1～7.thrA、purE、aroC、sucA、hisD、dnaN、hemD基因；8.阴性对照

2.5 沙门菌分离株耐药性检测结果

2.5.1 沙门菌分离株药敏试验结果 药敏试验结果显示，全部菌株对青霉素、四环素等10种抗生素存在不同的耐药率，其中对青霉素的耐药率高达100%(75/75)(图2A)，表明每株菌至少对一种抗生素耐药，而对头孢他啶、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素和左氟沙星5种抗生素均敏感。鸡伤寒沙门菌除了对头孢他啶、妥布霉素等5种抗生素敏感外，对其余10种抗生素均存在不同程度的耐药率，而鸡白痢沙门菌仅对青霉素、阿莫西林、氨苄西林和链霉素4种抗生素存在不同程度的耐药率，对其余11种抗生素均敏感。

A.耐药率；B.耐药基因检出率

2.5.2 两种血清型沙门菌耐药谱型及多重耐药统计 对10 种抗生素存在耐药率的菌株共产生了7种耐药谱型，耐药谱型最多由5种抗生素药物组成，两种血清型菌株优势耐药谱均为PEN，但鸡伤寒沙门菌仅次于优势耐药谱的为TET-ENR-DOX-SXT-PEN(12株)，而鸡白痢沙门菌则为AMX-PEN-AMP(9株)。耐3 类及以上抗生素药物为多重耐药，分离菌株多重耐药率达28.00%(21/75)，且集中于鸡伤寒沙门菌，占该血清型38.89%(21/54)(表1)。

表1 沙门菌耐10种抗生素的耐药谱

2.5.3 沙门菌分离株耐药基因检测结果 耐药基因检测结果显示，A、C和E检出率均高达 100%(75/75)；、2、A检出率则分别达8.00%(6/75)、10.67%(8/75)、26.67%(20/75)，但3个基因在两种血清型沙门菌中的检出率存在较大差异,如A基因主要集中于鸡伤寒沙门菌；、A2、B、3、A1、B和B均未检出(图2B)。

2.6 沙门菌分离株毒力基因检测结果

毒力基因检测结果显示，毒力岛SPI-2(L)基因及细胞毒素B基因均未检出，除了毒力质粒B基因的检出率稍低外，为89.33%(67/75)，其余6种毒力基因SPI-1(A)、SPI-3(C)、SPI-4(A)、SPI-5(B)、C和的检出率均高达100%(75/75)。

3 讨 论

沙门菌给畜禽养殖业造成巨大经济损失的同时，还严重威胁着人类健康。本研究从发病蛋鸡中共分离到鸡-雏沙门菌75株，MLST分型鉴定出ST92序列型鸡白痢沙门菌21株，ST78序列型鸡伤寒沙门菌54 株，鸡伤寒沙门菌为优势血清型，Haque等在孟加拉国5个行政区分离到的214株鸡源沙门菌中，检出的优势血清型同样为鸡伤寒沙门菌，表明该血清型为禽类养殖中重要的病原菌之一。

畜禽养殖中广泛使用的抗菌药，虽能有效降低死亡率，但不能消除动物群中的感染，停止用药后仍会受到感染，造成细菌耐药性的增加，且抗菌药可通过食物链的传递造成人类对多种抗生素的耐药性增强。本次分离的沙门菌中共存在7种耐药谱，多重耐药率较高达28%，且集中于鸡伤寒沙门菌，因此在临床预防和治疗过程中应做到科学合理、规范使用抗菌药物，禁止滥用。耐药基因作为细菌产生耐药性的重要机制之一，可经质粒、转座子或整合子之类可移动性遗传元件在不同菌株间进行水平传播，还可垂直传播，促使菌株产生耐药性。本次分离菌株携带编码β-内酰胺类相关基因仅检出，与孙朋浩等的研究相似，均以的检出率较高，该基因为β-内酰胺类耐药菌携带率最高的耐药基因。四环素类仅检出A基因，且集中于鸡伤寒沙门菌，Ahmed和Shimamoto发现埃及禽源沙门菌A是主要的四环素类耐药基因。磺胺类仅检出2基因，且检出率远低于徐耀辉等在不同地区分离的沙门菌的检出率。所有菌株均检出喹诺酮类A、C和E基因，却仅检出13株菌耐喹诺酮类药物，表明这13株沙门菌可能在检出的喹诺酮类A、C和E基因中有个别或全部基因的耐药决定区发生了基因突变，或者它们还存在其他耐药基因和耐药途径等。

对分离菌株的5个主要毒力岛核心蛋白基因检测结果显示，全部菌株SPI-2(L)基因未检出，其余4个基因均检出；毒力质粒与肠毒素基因检出率同样较高，同样为沙门菌的重要毒力因子；沙门菌细胞致死性肿胀毒素(cytolethal distending toxin, CDT)B基因未检出，王月等研究发现，毒力基因B主要分布于伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌中，该基因携带情况可能与血清型差异、宿主差异等因素有关。本研究中，毒力基因检出率均较高，预示本次分离菌的致病性可能较强，存在很大的潜在危险性。

4 结 论

2017—2019年云南地区鸡源沙门菌主要存在鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌2种血清型，多重耐药情况较为严重，耐药基因与毒力基因检出率较高，鸡伤寒沙门菌多重耐药率、耐药基因检出率高于鸡白痢沙门菌。