束缚应激对小鼠卵巢氧化损伤的实验研究

高 源，郭翠娟，刘仁平，徐良全

(1.南昌大学a.药学院2019级； b.基础医学院生理学教研室，南昌 330006； 2.丰城市妇幼保健医院妇幼保健科，江西 丰城 331100)

卵巢储备是指卵巢内存留卵泡的数量和质量，能反映女性的生育潜能和生殖内分泌功能。卵巢储备功能下降(DOR)导致女性生育能力减弱及性激素缺乏，进一步可发展为卵巢早衰(POF)。近年来，DOR发病率有逐年上升趋势，严重影响着女性的生殖健康和生活质量。本课题组前期的研究发现应激可以导致卵巢储备功能下降[1]。以往的研究[2-3]证实应激通过影响内分泌功能影响生殖功能；长期应激条件下，是否会导致卵泡细胞的氧化损伤，少见报道。本研究以束缚方法建立小鼠的应激模型，通过测定卵巢中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量变化，进一步探究应激导致卵巢储备功能下降的损伤机制，明确心理问题对女性生殖健康的影响，为妇女更年期的推迟及卵巢早衰的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物分组及喂养

选取6～8周龄的健康雌性昆明系小鼠(南昌大学实验动物中心提供)，体重22 g左右，适应喂养3 d后，按随机数字表法分为：束缚1周组、束缚2周组和束缚3周组，及空白组，每组10只。喂饲普通饲料，自由饮水。动物房温度控制在(24±1)℃，湿度为40%～70%，光：暗周期为12 h：12 h。

1.2 应激动物模型的建立

以束缚方法建立动物的应激模型。如图1所示，束缚器具为大小可调节的小鼠固定器(由公司订做)，长度约为20 cm，将小鼠置于固定器内进行束缚应激，统一放置于水平桌面上。为避免动物产生束缚耐受，在保证每日束缚总时长不变的基础上，每天给与不定期的束缚。每天束缚总时长6 h。

1.3 实验试剂

SOD、GSH-Px及MDA活性检测试剂盒(ELISA试剂盒，购自南京建成生物工程研究所)；TRIZOL试剂盒(大连TaKaRa公司)；qRT-PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)；ECL发光试剂盒(大连TaKaRa公司)。

图1 小鼠束缚器具

1.4 实验仪器

微型高速离心机(美国Labnet公司)，FlexStation 3多功能酶标仪(Flexstation3 Molecular Devices)，752分光光度计(上海美析，型号UV1300)。荧光定量PCR检测仪(上海实维技术有限公司)，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白电泳仪(垂直电泳槽以及电泳转移槽，北京东方仪器厂)。

1.5 小鼠卵巢脏器指数的测定

根据脏器指数=器官重量/体重，测定各组卵巢脏器指数。

1.6 生化指标的测定

1.6.1 SOD、GSH-Px及MDA活性检测

在应激刺激第1、2、3周结束时，称取小鼠体重后脱颈处死，迅速取两侧卵巢组织，称重后，用冰冷的生理盐水漂洗去除血液，加生理盐水制成10%的组织匀浆，3000 r·min-1离心10 min，弃沉淀取上清液0.5 mL，按照相应各ELISA试剂盒的要求，在反应孔中加标准品或待测标本,每孔剂量为100 μL。在空白对照孔中加入稀释液，剂量为100 μL。然后在37 ℃条件下水浴加热进行孵育，孵育后对检测板进行洗涤，最后加酶标抗体进行酶联免疫反应。反应终止后，将检测板在酶标仪上进行检测，以空白对照孔调零，检测条件为532 nm，测定各孔OD值。

1.6.2 实时荧光定量PCR

用TRIZOL法提取卵巢总RNA，取1 g卵巢组织加入1 mL TRIZOL抽提总RNA，用稀释用的Tris-EDTA(TE)溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260 nm和280 nm处的吸收值，利用紫外分光光度计测定RNA溶液浓度，利用A260/A280测定总RNA的纯度(比值范围1.9～2.0)。取等量的RNA，利用反转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，储存于-80 ℃冰箱内。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒扩增cDNA，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。具体步骤为：92 ℃预变性30 s；92 ℃，变性5 s；57 ℃，退火30 s；34个PCR循环，以GAPDH为内参，2-△△Ct表示基因的相对含量。各基因引入序，SOD1，Forward(5′-3′):GCGGTCCAGCGGATGAAGAG;Reverse(5′-3′)，CCAATCACCACAAGCCAAGC。SOD2，Forward(5′-3′)：GCCTCCCTGACCTGCCTTAC;Reverse(5′-3′):TGATAGCCTCCAGCAACTCTCC;β-actin:Forward(5′-3′):GAGGGAAATCGTGCGTGAC;Reverse(5′-3′):GCATCGGAACCGCTCATT。

1.6.3 蛋白印迹

取各组小鼠卵巢组织约1 g，加入RIPA裂解液匀浆，在4 ℃，12 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清，蛋白定量。根据厂家说明，加入相应体积的蛋白loading buffer，沸水中水浴5 min。利用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白电泳仪，通过PVDF膜转膜2 h，5%的脱脂牛奶封闭2 h，一抗4 ℃摇床过夜，用HRP标记的二抗孵育1 h。最后用ECL发光试剂盒厂家显影检测。

1.7 统计学方法

应用SPSS 25.0统计软件，卵巢脏器指数，各束缚组与空白组的生化指标比较采用成组t检验，检验标准α=0.05；总SOD(T-SOD)、GSH-Px、MAD、SOD1、SOD2、SOD指标比较采用单因素多元方差分析，两两比较采用t检验，校正检验标准α=0.016 7。

2 结果

2.1 各组小鼠卵巢脏器指数

各束缚组的小鼠脏器指数均明显低于空白组(P<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠在不同心理应激时间点的卵巢湿重、脏器指数比较

2.2 束缚应激实验对小鼠卵巢组织SOD、GSH-Px及MDA的影响结果

各束缚组T-SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量比较如表2、图2所示。结果显示，各束缚组T-SOD活力与空白组相比显著降低(P<0.01)，各束缚组的MDA水平显著高于空白组(P<0.01)，且各束缚组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，且相关分析表明T-SOD活力与MDA水平变化呈一定负相关(r=-0.883，P<0.01)，随着束缚应激实验周数增加，T-SOD活力呈一定降低态势，MDA含量呈上升态势。各束缚组的GSH-Px活力显著低于空白组(P<0.01)，且不同束缚组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，随着束缚应激实验周数增加，GSH-Px活力呈显著下降态势。

2.3 束缚应激实验对小鼠卵巢组织SOD表达水平的影响

在qRT-PCR实验结果中，与空白组相比，束缚组的SOD1和SOD2蛋白表达降低，其中SOD1可见显著降低(P<0.05)，验证了束缚应激2周和3周显著抑制了卵巢组织中SOD1和SOD2表达(图3A—B所示)；在蛋白印迹实验中，与空白组相比，束缚2周和3周的SOD表达被抑制(图3C—D)。

表2 各组T-SOD、GSH-Px及MDA比较

*P<0.05，**P<0.01与空白组比较,n=8图2 各组T-SOD、GSH-Px、MDA比较

A:SOD1 mRNA相对表达水平；B:SOD2 mRNA相对表达水平；C—D：SOD蛋白表达水平。

3 讨论

SOD是一种机体内的生物活性物质，体内的T-SOD含量高低与炎症发作、肿瘤增生、机体衰老等联系密不可分。GSH-Px是一种机体内广泛存在的过氧化物分解酶，主要存在于线粒体中，硒是GSH-Px酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，清除体内的自由基，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。因而通过检测以上两个因子，能反映体内自由基、脂质过氧化的程度，同时可以了解机体的氧化和抗氧化系统的情况。MDA是脂质过氧化反应的重要产物可引起蛋白质和核酸等生物大分子的交联聚合，作为生物膜系统脂质过氧化损伤反应的一种产物，是反应机体氧化损伤程度最经典也是最有效的指标之一。

氧自由基，也被称为活性氧(ROS)，产生于细胞正常代谢的过程，同时具有“双重作用”。从一方面来说，它可以作为细胞内的信号级联的次级信使；另一方面，以ROS为代表的氧化性物质的产生、消除失衡或外源性氧化物质的过量摄入,将会导致氧化性物质在细胞内蓄积从而产生氧化反应状态[4-5]，这一过程被称为氧化应激。活性氧的生成增加会破坏机体的抗氧化保护作用进而引起DNA损伤、脂质过氧化、蛋白修饰等效应，这些效应则会涉及癌症、心血管疾病、风湿性关节炎、神经系统疾病等多种疾病[6]。体内的酶抗氧化系统可以通过清除ROS来减弱氧化应激的影响。

转基因小鼠模型等数据表明，一些抗氧化酶在保护细胞活性氧(ROS)方面可能发挥重要的作用[7-9]，对于卵泡发育和存活至关重要[10-11]。氧化应激可以从原始卵泡开始在原始卵泡、生长卵泡和排卵前卵泡3个阶段均影响卵泡发育与存活，甚至包括卵母细胞和早期胚胎的各个阶段；同时，ROS也可能在腔卵泡细胞凋亡的启动程序中发挥重要作用[7]。而GSH耗竭则会导致体内和培养腔卵泡颗粒细胞凋亡的腔卵泡闭锁，影响雌鼠的生育功能。导致氧化应激反应的条件如伽马射线照射、化疗药物或者多环芳香烃均可以诱发卵泡凋亡[12-14]；想要保护细胞凋亡，则可以加入抗氧化剂并在ROS增加和氧化应激的迹象出现之前，引起分子逆转。

慢性束缚模型能够诱导产生抑郁样行为[15-17]，但是有报道表明随着束缚时间的延长，动物渐渐产生了耐受状态，本研究的预实验也验证了这一现象，为此，本实验参照文献[18]对束缚方法作改进，在每日束缚总时长6 h不变的基础上，每天给与不定期的束缚来消除耐受引起的实验误差。

本实验结果显示，在建立慢性束缚模型后，伴随着脏器指数下降的同时，各组卵巢氧化标记物的活性发生显著性变化，各束缚组较空白组MDA含量显著升高，各束缚组间比较差异有统计学意义(P<0.01)；束缚应激2、3周组与空白组相比T-SOD活力降低(P<0.01)，且相关分析表明T-SOD活力与MDA水平变化呈负相关(r=-0.883，P<0.01)，随着束缚应激实验周数增加，T-SOD活力呈一定降低态势，MDA含量呈上升态势；各束缚组GSH-Px活力低于空白组(P<0.01)，且不同束缚组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。

为了进一步探究束缚应激对小鼠卵巢组织SOD的作用机制，本实验取小鼠卵巢组织，提取总RNA和蛋白，qRT-PCR和蛋白印迹实验结果显示，束缚应激2周和3周卵巢组织中SOD1和SOD2表达被抑制(P<0.05)，提示束缚应激促进卵巢储备功能下降的损伤机制可能是通过抑制SOD的表达，促进卵巢组织氧化应激损伤的发生，最终导致卵巢早衰。

总之，慢性束缚小鼠卵巢中T-SOD和GSH-Px的活力下降，MDA的含量升高，束缚应激可能是通过抑制SOD的表达导致卵巢出现氧化应激损伤。