预血管化组织工程骨体外构建策略

王建，叶岑雪，甄平，樊博

(1.甘肃中医药大学第一临床医学院，兰州 730000； 2.联勤保障部队第九四〇医院骨科中心，兰州 730050；3.中日友好医院重症医学科，北京 100029)

临界尺寸骨缺损的修复仍然是骨科、颌面外科的一个挑战。临床常用的临界尺寸骨缺损修复方法，如自体或异体骨移植、骨搬移、支架材料植入，都有其特定的适应证和局限性[1]。血管化和矿化是骨发育过程中的偶联过程，血管化在骨形成和再生过程中起着至关重要的作用[2]。骨组织工程作为骨缺损修复的新兴策略，面临着血管化不足的挑战[3]。传统骨组织工程血管化策略主要通过优化支架材料、增加生长因子递送系统或接种内皮细胞来刺激宿主血管向移植物内长入或内皮细胞生成血管[4]。然而，新生血管的长入速度每周通常不超过1 mm[5]，移植物仍需要较长时间血管化。因此，植入缺损的组织工程骨移植物常因缺乏快速的营养和氧供应而坏死。为了克服这一问题，有必要在移植物内部预先构建一个成熟的微血管网，这些微血管网可以在移植后与宿主血管系统快速吻合实现移植物快速血液供应[6]。因此，预血管化对工程骨组织植入缺损后的成活及与周围宿主组织的整合、重构至关重要[7]。现就微血管生成机制和血管细胞来源以及预血管化组织工程骨的体外构建策略进行综述。

1 微血管生成机制

了解血管生成机制可为构建预血管化工程骨选择合适的细胞类型提供参考。微血管由微动脉、毛细血管和微静脉组成。其中毛细血管直接参与周围组织的物质运输，因此对维持组织成活十分重要。毛细血管的细胞成分由构成血管腔的内皮细胞和起支持作用的周细胞组成，周细胞通过细胞间连接和缝隙连接附着于内皮细胞[8]，起介导旁分泌信号转导和稳定血管的作用[9]。毛细血管外层为基膜，由多种蛋白质和蛋白多糖组成[10]。平滑肌细胞存在于除了毛细血管外的其他血管周围[11]。通过血管平滑肌收缩舒张可调节器官组织的血流量[12]。

胚胎原始血管网的形成涉及胚胎中胚层血管母细胞的分化、迁移和融合，这个过程称为血管发生[13]。在成年期，血管发生则通过从骨髓招募内皮前体细胞来组装新血管[14]。在形成初始血管网之后，可通过血管生成以发芽的形式扩张原有的血管[4]。其中，血管生成是一个动态过程，依赖于内皮细胞与血管周围细胞和细胞外基质的密切相互作用。简单来说，血管生成信号激活静态内皮细胞，使内皮细胞松弛细胞间连接[13]，分泌降解基膜的基质金属蛋白酶[15]。随后内皮细胞迁移到周围基质中，并相互连接形成新的微血管网[4]。这些血管网随后通过壁细胞(周细胞或平滑肌细胞)的招募以及细胞外基质的沉积而稳定、成熟[14]。

2 血管细胞来源

合适的内皮细胞和支持细胞类型对血管的结构和功能完整非常重要。血管细胞来源主要包括内皮细胞、内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)及血管壁细胞。组织来源的内皮细胞主要包括人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、人真皮微血管内皮细胞、人内皮集落形成细胞(endothelial-colony-forming cells,ECFCs)等。其中，HUVECs由于分离简单、血管生成潜力大，是最常用的内皮细胞来源[12]。然而，HUVECs来源有限，需要预先从脐带获取并保存。EPCs可从脐带血或外周血中获取。然而，由于这些细胞可以来自不同的组织，EPCs具有可变的谱系和表型，因此很难预测其血管生成潜力[16]。血管壁细胞包括周细胞和平滑肌细胞，起支持和稳定血管的作用。

从血管等人体组织中获得的血管细胞存在来源有限、因个体原因导致的细胞活性差异等缺点[17]。因此，将间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、胚胎干细胞或诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)诱导分化为血管细胞越来越受欢迎[18]。与原代内皮细胞相比，iPSCs来源的内皮细胞具有较小的异质性[19]。但是，在iPSCs进入临床治疗之前，必须解决伦理和安全性问题。

3 预血管化组织工程骨体外构建策略

研究人员已经开发了几种体外构建预血管化组织工程骨的策略，主要包括共培养、球体、细胞膜片以及3D打印。

3.1共培养 细胞共培养是最常用的预血管化组织工程骨构建策略。内皮细胞或EPCs与支持细胞共培养于支架可实现支架内微血管形成。骨髓MSCs(bone marrow MSCs,BMSCs)、脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)、胚胎干细胞、iPSCs是支持细胞(壁细胞)常用来源。虽然作为组织特异性细胞来源的成体干细胞(如BMSCs、ADSCs)与内皮细胞共培养时对新生血管起周细胞样作用，但在共培养体系中额外添加周细胞被证明在骨缺损修复中促进血管生成[20]。已经有多种支架材料被用于支持共培养细胞生成血管，如由胶原、纤维蛋白、甲基丙烯酸酰化明胶制成的水凝胶，由聚乳酸-羟基乙酸共聚物、磷酸钙制成的多孔支架，由聚己内酯制成的静电纺丝支架，以及脱细胞骨支架等[3,20-26]。Subbiah等[21]将人BMSCs与HUVECs以4∶1的比例在胶原水凝胶中共培养7 d预构了血管化凝胶骨修复支架，在颅骨缺损修复模型中，预血管化水凝胶组的骨体积、覆盖面积、血管分布等成骨参数明显优于自体骨阳性对照组。

支架内微血管网的形成受到细胞来源及比例、培养条件、接种策略等因素的影响。王斯琪等[27]分别将人骨髓、脂肪和脐带血来源的MSCs与EPCs共培养以形成血管，脂肪来源MSCs在体外和体内促EPCs形成血管并维持其稳定的能力高于骨髓和脐带血来源MSCs。不同供体来源的细胞在功能方面存在显著差异，供体变异会影响细胞分化，从而影响实验结果的重复性[19]。同时，同一供体不同部位获取的细胞在血管生成方面也存在显著差异。脐带血来源的人ECFCs被证明在增殖和血管生成方面优于外周血分离的ECFCs[19]。在旋转瓶生物反应器系统中，研究人员筛选了最佳的共培养细胞比例，MSCs与HUVECs以1∶1的比例共培养最有利于血管生成[28]。此外，不同类型培养基的使用直接影响共培养体系的血管生成和成骨的结果。体外共培养7 d形成的血管网在随后持续14 d的血管生成培养基、成骨培养基或混合培养基(血管生成培养基与成骨培养基以1∶1混合)刺激下显示出不同的结果[23]。在血管生成刺激下血管网继续扩展，在混合培养基中可以维持血管网，而成骨培养基则促进成骨和矿化但会消除血管网。混合培养基可以支持多相组织形成，但在体外工程骨组织中实现高效的血管生成和成骨仍须寻找其他策略支持。

在成骨培养基中共培养BMSCs和HUVECs能促进骨生成但抑制血管生成[23,29]。这可能是通过两种不同的机制实现的。其一，BMSCs可在成骨培养条件下分泌一种血管抑制因子Cxcl9，Cxcl9可拮抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，阻止VEGF与HUVECs结合，从而阻断共培养体系的血管生成[29]。其二，成骨培养基中的地塞米松可刺激内皮细胞分泌金属蛋白酶组织抑制剂3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3,TIMP-3)，TIMP-3与VEGF-A竞争结合VEGF受体2，从而抑制血管生成[30]。通过雷帕霉素阻断哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/信号转导及转录活化因子1信号通路抑制Cxcl9的表达或经缺氧预处理通过缺氧诱导因子-1α下调TIMP-3的表达，促进VEGF受体2的磷酸化，进而提高成骨培养条件下共培养体系的成骨分化和血管生成[30]。同样，在另一项研究中发现，相对于长期缺氧，1～2周的短期重复缺氧(2% O2，8 h)能促进共培养体系的血管生成[31]。在培养体系中添加促血管生成成分，如富血小板纤维蛋白、胰岛素样生长因子-1可明显促进VEGF的表达，并显著增加血管生成[32-33]。另外，细胞共培养于动态培养系统中能促进血管生成和成骨。然而，静态共培养第3天，成骨及血管生成相关基因的表达高于动态共培养第3天，这可能是因为共培养早期细胞正在适应环境，并释放旁分泌信号，动态培养破坏了这种早期生长，因此先静态后动态的培养策略可应用于后续的研究中[34]。在共培养中，细胞接种顺序可影响毛细血管的形成。与HUVECs共培养对MSCs的成骨分化有抑制作用，而MSCs的延迟接种策略可以减弱这种抑制作用[28]。

3.2球体 球体模拟了自然组织的三维微环境，被广泛用于再生医学的血管生成单元[35]。球体可通过不同的技术方法来制备，包括悬浮培养技术和非黏附微孔培养技术[5,36-38]。与单一细胞培养的球体相比，共培养的球体能更好地模拟天然组织异质细胞间的相互作用。在共培养球体中加入血管形成细胞可以产生血管化的骨组织[35]。在骨组织工程中，共培养细胞球体在支架材料内部充当血管生成的旁分泌刺激因子并直接参与生成微血管网[35]。在不同来源内皮细胞及组织特异性细胞构建球体血管生成的研究中，内皮细胞的主要来源为HUVECs和iPSC，而组织特异性细胞来源主要为BMSCs和ADSCs。同时，培养的球体通常包裹在水凝胶内形成可置入的支架[39]。与细胞共培养类似，共培养球体的功能同样受到细胞来源、比例以及培养条件影响。Heo等[40]发现与单纯BMSCs球体相比，包裹在胶原/纤维蛋白水凝胶中的BMSCs/HUVECs共培养球体显示出更好的细胞扩散和增殖，能增强成骨分化并促进血管网形成。Roux等[41]比较了不同细胞比例HUVECs/BMSCs球体的血管生成效率，发现血管网的形成需要BMSCs，并且取决于两种细胞类型的比例，含50% BMSCs的球体能形成最广泛的血管网。同时，Mishra等[36]通过悬浮培养技术培养了1∶1的HUVECs/BMSCs球体，纤维蛋白凝胶包裹的球体在体外预培养3周后血管显著增加，裸鼠皮下植入实验显示人CD31阳性血管灌注了小鼠的血液。内皮细胞和干细胞组合的血管网生成高度依赖氧，低氧条件会抑制血管网的自组装[5]。Nyberg和Grayson[5]研究了ADSCs球体预血管化所需的最短常氧孵育时间，4 d的常氧孵育期是稳定血管形成所需的最短时间。另外，球体制备技术已实现高通量自动化生产，这为球体作为生物墨水成分进行3D生物打印奠定了基础。Celik等[42]分别使用miR-148b和miR-210转染并诱导ADSCs为成骨细胞和EPCs球体，并将这些异型球体进行了生物打印以模拟骨哈弗斯管结构。

3.3细胞膜片 细胞膜片是一种无支架组织。细胞膜片保存了完整的细胞连接和细胞外基质，从而在促进细胞间交流的同时可为血管化提供良好的微环境[43]。通过在温度响应皿内培养细胞可制作出细胞膜片[44]。温度响应皿中涂覆了温度响应聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺[poly(N-isopropylacrylamide，PNIPAM)]。PNIPAM在37 ℃时疏水并允许细胞黏附。在形成完整的细胞膜片后，将温度降低到32 ℃，PNIPAM返回亲水状态并导致细胞膜片脱离[44]。在培养皿壁安放锚定装置能防止细胞膜片在培养和收获时收缩[45-46]，而将培养皿放置于轨道平台上进行波浪式运动可促进细胞膜片形成[45]。通常，将内皮细胞接种于成骨细胞膜片上，或将内皮细胞膜片夹于成骨细胞膜片之间，通过层层堆叠来构建预血管化组织工程骨[18，47]。Pirraco等[48]将一层MSCs膜片覆盖在接种或未接种HUVECs的MSCs膜片上形成双层的细胞膜片复合结构，接种HUVECs的复合细胞膜片植入裸鼠皮下后生成的骨组织较未接种HUVECs组更快、更多。MSCs和胚胎干细胞等多能干细胞在血管生成条件下可增殖分化为内皮细胞或壁细胞，可作为细胞膜片堆积形成血管化组织的替代细胞来源。Wang等[18]在成骨分化ADSCs膜片上接种ADSCs来源的EPCs，3个堆叠后形成厚的复合细胞膜片，复合细胞膜片植入裸鼠皮下形成了致密且血管分布良好的新骨组织，植入颅骨缺损后的重建范围较单纯ADSCs膜片组更大。细胞膜片可作为生物纸用于3D生物打印，并且当生物纸细胞排列方向与打印线平行时，有利于血管结构的形成[46]。因此，细胞膜片表面微图案化可能会促进接种的内皮细胞形成血管。另外，相较于未成骨分化的BMSCs膜片，成骨分化的BMSCs膜片接种HUVECs的血管形成能力更强[47]。

3.43D打印 3D打印又称增材制造，通过在计算机辅助设计下逐层沉积材料来构建物体。目前，可通过基于生物墨水的3D生物打印(直接打印)或基于牺牲网络的牺牲打印(间接打印)来构建预血管化组织工程骨。

3D生物打印使用包含细胞的生物墨水直接打印血管网，实现细胞在3D构建物中准确定位，而无需接种细胞。将HUVECs与BMSCs共培养的纤维蛋白凝胶作为生物打印墨水可实现血管网的直接打印[6]。使用负载成体干细胞的骨生物墨水和负载内皮细胞的血管生物墨水混合生物打印可实现复杂人工骨组织高空间分辨率打印[49]。在预先打印的明胶纳米羟基磷灰石支架连通大孔内滴入负载HUVECs和人BMSCs的凝胶生物墨水可获得血管化人工骨[50]。作为血管化单元的细胞球体或脂肪组织基质血管碎片可取代单细胞用作生物墨水成分[51-52]。将负载脂肪组织基质血管碎片的水凝胶沉积打印于预打印的聚己内酯/羟基磷灰石支架通道内，短期低氧培养后构建了血管化工程骨组织，短期缺氧调节可促进支架内微血管的形成，并促进支架内微血管与宿主血管系统整合[52]。另外，生物墨水中的MSCs对血管生成至关重要，与单纯HUVECs相比，打印含1∶1比例的MSCs/HUVECs的生物墨水能阻止胶原生物纸上内皮细胞过分扩散，从而保存血管走行图案[53]。

牺牲打印利用牺牲材料如Pluronic F127、海藻酸盐，打印微通道网络并包埋于含或不含种子细胞的支架材料中，牺牲材料通过降解、液化或物理取出等方法去除后便留下空心微通道，之后通过在空心微通道内接种内皮细胞(和支持细胞)可实现支架血管化[54-55]。Zheng等[54]采用Pluronic F127 作为打印墨水打印了血管网图案，并包埋于负载真皮成纤维细胞的甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶中，4 ℃时Pluronic F127液化去除后形成微通道，通过在微通道内灌注接种HUVECs实现了预血管化组织的构建。Twohig等[55]通过双打印系统使用磷酸钙墨水和藻酸盐牺牲墨水打印了堆叠的磷酸钙纤维框架和微通道网络，打印结构包埋于负载MSCs的GelMA水凝胶中，物理取出藻酸盐牺牲材料后留下了空心微通道，通过在微通道内接种共培养MSCs和内皮细胞实现了组织工程骨预血管化。

4 小 结

组织工程骨体外预血管化策略是通过允许自身微血管网与宿主微血管系统快速吻合来提高移植物成活率。组织特异性细胞与内皮细胞共培养是工程骨支架获得血管网、增加血管密度以及与宿主血管快速吻合的关键。此外，植入前的体外预培养可以为血管网的形成提供时间，短期重复低氧处理可促进支架内微血管的形成。然而，根据骨缺损类型、大小及部位选择最佳的预血管化策略仍须进一步研究。除了工程技术，不同策略的最佳共培养细胞来源和比例、培养基成分、低氧调节时机和时间均是后续研究的重点。此外，这些策略需要在大动物模型和大体积移植物上验证之后才可应用于临床。

总之，体外构建预血管化组织工程骨为临界尺寸的骨缺损的修复带来了新的思路。虽然尚未进入临床应用，但这些策略解决了传统骨组织工程血管化不足的问题。