2型糖尿病患者血清磷脂DHA与炎症因子相关性研究

傅晶蕾　褚晨吟　周国忠　楼大钧

[摘要] 目的 研究2型糖尿病患者血清磷脂DHA與炎症因子核因子-κB（NF-κB）、干扰素-γ（IFN-γ）是否具有相关性。 方法 选取2019年10月至2021年1月期间浙江省绍兴市人民医院内分泌科收治的2型糖尿病患者53例（T2DM组）和2020年11～12月浙江省绍兴市人民医院体检中心健康者51例（NC组），用高效气相色谱法测定血清磷脂DHA，流式细胞仪检测NF-κB及IFN-γ水平。比较两组的血清磷脂DHA、NF-κB及IFN-γ水平，分析血清磷脂DHA与NF-κB、IFN-γ的相关性。结果 T2DM组NF-κB表达水平明显高于NC组[5.79（4.21，9.02）% vs. 1.81（1.26，4.18）%，P<0.01]。T2DM组IFN-γ浓度明显高于NC组[11.94（9.61，15.67）pg/ml vs. 7.51（6.37，9.48）pg/ml，P<0.01]。T2DM组血清磷脂DHA水平明显低于NC组[（4.57±1.30）% vs. （6.51±1.28）%]，P<0.01）。Spearman相关性分析示血清磷脂DHA与NF-κB、IFN-γ呈负相关（r=-0.294，-0.302，P均<0.01）。 结论 2型糖尿病患者血清磷脂DHA与健康者存在差异，血清磷脂DHA与NF-κB、IFN-γ呈负相关。

[关键词] 2型糖尿病;二十二碳六烯酸;核因子-κB;干扰素-γ

[中图分类号] R587.1          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2022）15-0122-04

Correlation between serum phospholipid DHA and inflammatory factors in patients with type 2 diabetes mellitus

FU Jinglei CHU Chenyin  ZHOU Guozhong LOU Dajun

1.Department of Endocrinology，Shaoxing People′s Hospital in zhejiang Province the First Affiliated Hospital of Shaoxing University，Shaoxing 312000，China;2.College of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou 310011，China;3.Department of Clinical Laboratory， Shaoxing People′s Hospital in zhejiang Province the First Affiliated Hospital of Shaoxing University， Shaoxing 312000，China

[Abstract] Objective To investigate the correlations between serum phospholipid DHA and inflammatory factors of nuclear factor-κB （NF-κB） and interferon-γ （IFN-γ） in patients with type 2 diabetes mellitus. Methods A total of 53 patients with type 2 diabetes mellitus （the T2DM group） who were admitted to the Department of Secretion and Metabolism of Shaoxing People′s Hospital from October 2019 to January 2021 and 51 healthy subjects （the NC group） who were admitted to the Physical Examination Center of Shaoxing People′s Hospital from November to December 2020 were selected. Serum phospholipid DHA was determined by the high-performance gas chromatography and NF-κB and IFN-γ levels were determined by the flow cytometry.Serum phospholipid DHA， NF-κB and IFN-γ levels were compared between the two groups，and the correlations between serum phospholipid DHA and NF-κB and IFN-γ were analyzed. Results The expression level of NF-κB in the T2DM group was significantly higher than that in the NC group[5.79（4.21， 9.02） % vs. 1.81 （1.26， 4.18） %， P<0.01]. The IFN-γ concentration in the T2DM group was significantly higher than that in the NC group [11.94 （9.61， 15.67）pg/ml vs. 7.51 （6.37， 9.48） pg/ml，P<0.01]. The serum phospholipid DHA level in the T2DM group was significantly lower than that in the NC group [（4.57±1.30） % vs. （6.51±1.28） %，P<0.01]. The Spearman correlation analysis showed that serum phospholipid DHA was negatively correlated with NF-κB and IFN-γ（r=-0.294，-0.302，P<0.01）. Conclusion Serum phospholipid DHA of type 2 diabetes mellitus patients is different from that of healthy subjects， and serum phospholipid DHA is negatively correlated with NF-κB and IFN-γ.

[Key words] Type 2 diabetes mellitus （T2DM）; Docosahexaenoic acid （DHA）; Nuclear factor-κB （NF-κB）; Interferon-γ （IFN-γ）

目前认为核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）[1]、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）[2]等炎症因子与2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）发病机制之间有着密切的联系。在糖尿病疾病进程中膳食脂肪酸也起到重要作用，尤其是n-3多不饱和脂肪酸，可以一定程度上改善进行性胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、降低炎症反应，对疾病发展具相对程度的保护作用。在前期研究中，笔者发现n-3多不饱和脂肪酸可以起到降低血清高敏C-反应蛋白水平的作用，从而减轻T2DM炎症反应[3]。二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）在n-3多不饱和脂肪酸中有着重要地位。在外周血中，DHA与磷脂结合形成磷脂脂肪酸，能够显示出体内n-3多不饱和脂肪酸的摄入情况[4]。因此，本研究通过测定外周血血清磷脂DHA和炎症因子NF-κB、IFN-γ，分析血清磷脂DHA与炎症因子NF-κB、IFN-γ表达间的相关性，以提供T2DM相关膳食指导，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年10月至2021年1月期间浙江省绍兴市人民医院内分泌科收治的T2DM患者53例（T2DM组），年龄18～70岁。纳入标准：①参照1999年WHO制定的标准，纳入研究对象的患者均达到了糖尿病诊断要求[5];②经治疗的药物（如降高血压药）稳定超过3个月以上。排除标准：①目前仍在使用各类降糖药物进行治疗，但不包括正在使用外胰岛素或胰岛素增敏剂等;②既往无阿司匹林，维生素A、E、C的服用史，或使用过各类抗氧化药物;③无合并急性并发症，未罹患恶性肿瘤，处于妊娠期，或患血液系统疾病，肝肾功能不全。选取51例（NC组）于2020年11～12月来自浙江省绍兴市人民医院体检中心健康者，年龄20～65岁。排除标准：①研究对象OGTT试验排除糖尿病[5];②均无明确的心脏、肝脏、肺部及肾脏等疾病，伴有急、慢性进行性感染，恶性肿瘤等情况;③均无糖尿病、高血压家族史。本研究中，向各研究对象说明实验情况，获得知情同意且相关材料提交后经由笔者医院医学伦理委员批准（伦理编号：20211203150 0000348155）。

1.2 体格检查

由专业人员测量实验人员的身高、体重、收缩压（systolic blood pressure，SBP）和舒张压（diastolic blood pressure，DBP），并计算出相应的体质量指数（body mass index，BMI）。

1.3 血生化检测

研究对象空腹状态下（过夜禁食10～12 h）抽取适量的静脉血，从中测量糖化血红蛋白（HbA1c）含量，获得FPG、FINS等生化指标数据。采用G8糖化血红蛋白测定仪（日本东曹公司）来测定HbA1c、AU5800全自动生化分析仪（美国贝克曼公司）测定FPG、I2000发光仪（美国雅培公司）测定FINS。

1.4 NF-κB的测定

研究对象空腹状态下（过夜禁食10～12 h）抽取2 ml次晨静脉血。2 h内加入2 ml Ficoll细胞分离液（美国GE Healthcare公司），设置离心转速为2000 r/min，离心时间10 min后吸取单核细胞层，加入10 μl CD14抗体（鼠抗人），在2～8℃冰箱内孵育约30 min，随后3000 r/min离心，时间为5 min，洗涤离心后去上清液，随后加入细胞破膜剂，转速和时间同前，离心洗涤去上清后加入10 μl NF-κB抗体（鼠抗人），在2～8℃冰箱内孵育约40～50 min，最后洗涤离心后得到的样本加入PBS固定液，使用Navios流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）进行检测，储存并以 Cell Quest 软件系统分析结果。所使用到的NF-κB检测试剂从美国BD公司采购，在执行相关使用操作时，严格遵守操作规程和操作说明书。

1.5 IFN-γ的测定

研究对象空腹状态下（过夜禁食10～12 h）抽取2 ml次晨静脉血，2 h内在3000 r/min的离心速度下离心10 min，分离血清，从血清中抽取适量用作研究，另取适量标准品，分别向其中加入表面包被有IFN-γ的荧光强度的捕获微球和带有PE荧光标记的抗体结合体，形成双抗夹心复合物，再由Navios流式细胞仪分析测定样本中的细胞因子成分及其含量。所使用到的IFN-γ检测试剂从美国BD公司购置，在执行相关使用操作时，严格遵守操作规程和操作说明书。

1.6 血清磷脂DHA测定

研究对象空腹状态下（过夜禁食10～12 h）抽取2 ml次晨静脉血，2 h内在3000 r/min的离心速度下离心10 min，分离血清，从血清中提取适量总脂用作研究，经萃取后，使用薄层色谱法将磷脂脂肪酸分离出来，而后经甲酯化处理的磷脂脂肪酸注入高效气相色谱仪中进行分析，并采集相关谱图，通过N2010色谱工作站处理后得到最终的分析结果。最后，在将标准品与其对照对照定性，获得峰面积数据（面积归一化法），从而得到其含量的分布。

1.7 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件分析数据，计数资料采用χ检验，计量资料如果属于正态分布，则以均数±标准差（x±s）表示，否则以中位数（四位数间距）[M（Q1，Q3）]表示。在進行组间检验时，采用两个独立样本t检验、秩和检验法。最后再利用Spearman分析得到DHA与NF-κB、IFN-γ的相关性检验结果，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T2DM组和NC组临床指标及生化特征比较

两组的年龄、性别方面都具有匹配性，两组FINS比较，差异无统计学意义（P>0.05）。两组的BMI、SBP、DBP、FBG、HbA1c、NF-κB、IFN-γ比较，差异有统计学意义（P均<0.01），且T2DM组要高于NC组;两组的血清磷脂DHA比较，差异有统计学意义（P<0.01），且NC组血清磷脂DHA要高于T2DM组（P<0.001）。见表1。

2.2 血清磷脂DHA与炎症因子相关性

Spearman相关性分析结果显示，血清磷脂DHA与NF-κB、IFN-γ均呈负相关（r=-0.294，-0.302，P均<0.01）。见表2。

3 讨论

炎症因子在IR及胰腺β细胞损伤中起十分重要作用。NF-κB是一种核转录因子，常见于单核细胞细胞质中。当Toll样受体4（toll-like receptors 4，TLR4）信号通路出现被异常激活的情况后，NF-κB转变成激活状态，并移位至细胞核内，调节靶基因的转录表达，从而影响胰岛素信号转导通路、降低利用和摄取葡萄糖的效率，导致机体IR形成[6-7]。IFN-γ是由活化T细胞产生，是具有细胞毒作用的细胞因子。在T2DM患者中，胰腺β细胞上Ⅰ类主要组织相容性复合体（major histo-compatibility complex，MHC）抗原分子表达异常，增加胰腺β细胞对细胞毒性T细胞的细胞毒作用的敏感度，易发生免疫性β细胞损伤[8]。此外，IFN-γ可以使跨膜蛋白TLR2和TLR4表达增加，影响炎症信号传导，刺激产生炎症因子，加剧胰岛素抵抗恶化[9]。本研究结果显示，炎症因子NF-κB、IFN-γ在T2DM患者中显著增高，表明NF-κB、IFN-γ可能在T2DM疾病炎症反应中起着重要作用。

DHA是一种重要的n-3多不饱和脂肪酸。在机体内，胰岛素调节作用受损主要表现在葡萄糖转运、糖原合成和基因表达方面，许多研究表明DHA与IR有密切联系[10]。Wei等[11]研究发现，DHA可以通过作用于 G蛋白偶联受体120和过氧化物酶体增殖激活物受体γ进行调节，激活胰岛素信号传递通路，使得葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）表达效率提高，起到改善IR的作用。相关研究表明，DHA可以通过改变细胞膜上磷脂成分变化，从而影响脂质-蛋白质的相互作用和NF-κB信号传导通路[12]，尤其抑制NF-κB信号通路在降低炎症因子水平和减少胰腺β细胞凋亡方面起到重要作用[13-14]。DHA还可以通过调节转录因子抑制Th1细胞分化来减少IFN-γ分泌，减轻细胞毒作用，减少靶细胞的免疫性损伤[15-16]。当膳食摄入多不饱和脂肪酸发生改变时体内炎症因子水平也会相应变化。KolobaricN等[17]在一项随机研究中发现，添加n-3多不饱和脂肪酸的饮食可以影响受试者体内脂质介质改变以及T淋巴细胞分泌细胞因子水平，最终抑制炎症反应。另有研究发现，当外源性补充DHA后，可以使细胞膜磷脂中n-3 PUFAs比例增加，通过抑制细胞中磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）来降低花生四烯酸衍生物和炎性代谢产物的产生水平[18-19]。DHA作为人体自身不能合成的必需多不饱和脂肪酸，其获取途径主要是饮食摄取。目前许多研究支持其具有抗炎特性，并且具有降低糖尿病患病风险的可能性[20]。本研究中发现，T2DM患者血清磷脂DHA偏低，表明n-3多不饱和酸摄入相对不足、机体抗炎能力相对减弱，而长期的炎症刺激可能会加剧IR恶化。因此在T2DM患者膳食中增加DHA摄入可能可以降低机体炎症反应，在一定程度上改善疾病的发展。

综上所述，NF-κB、IFN-γ可能是糖尿病发病过程中重要的炎症因子。T2DM患者存在膳食n-3不饱和脂肪酸摄入不合理、抗炎能力下降的情况，而外源性摄入DHA有可能降低炎症反应，最终减缓疾病进程。但本研究还存在一定的不足，需增加更多研究样本数量，今后还需开展临床或基础研究进一步增加可行性。

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（收稿日期：2021-09-22）