TOMM40 基因多态性及基因- 环境交互作用对血管性痴呆的影响

马玥 ，张鹏 ，卢杉

1.黑龙江省医院神经内二科，黑龙江哈尔滨 150000；2.黑龙江省医院老年神经内科，黑龙江哈尔滨 150000；3.黑龙江省医院医学影像科，黑龙江哈尔滨 150000

阿尔茨海默病是世界排名第一的痴呆类型疾病，血管性痴呆（vascular dementia, VD）是世界排名第二大痴呆类型的疾病， 脑血管因素引发的脑部组织损害造成的痴呆综合征是该病的主要发病原因，分类型为缺血性脑血管疾病、 急慢性缺氧脑血管疾病和出血性脑血管疾病， 约占老年认知障碍病因的20%,其临床表现为认知功能减退、记忆障碍、情感障碍、行为异常、 生活自理能力及其他社会功能下降，严重影响患者的生存质量[1-3]。 血管性痴呆受多因素影响，认为其与基因、环境、基因-环境共同作用发生。 在研究VD 疾病发病因素时，如果单纯考虑遗传因素或环境因素单一因素对疾病病因的相关性，忽略基因-环境两因素的交互作用，会对病因的风险评估出现误差[4-6]。该研究选择2020 年6 月—2021 年6月门诊及住院治疗的100 例VD 患者入组， 对照组选取没有认知功能障碍的老年人100 名入组， 探索基因、 周围环境和基因-环境之间的交互作用机制，以此来更好地解释血管性痴呆疾病的发生发展过程，进行更为有效的预防VD 发生的风险预测，对该病具有重大的指导意义。 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取门诊及住院治疗的100 例VD 患者为病例组， 同时选取无认知功能障碍的健康老年人100 名作为随机对照组。研究对象患者签订知情同意书，采用简易智能状态检测量表（MMSE）和蒙特利尔认知评估量表（MoCA）两个量表检测评估[7]，评分测试由该院专科医师完成，避免出现偏倚。参与患者均了解该次研究的目的， 均自愿参加并该次研究方法和内容经过医院伦理委员批准。

病例组纳入标准： 均符合瑞士日内瓦国际神经科学研究协会和美国国立卫生院两个权威机构制定的血管性痴呆疾病的诊断标准； 颅脑CT、MRI 影像检查证实脑内有多发腔隙性梗死或梗死灶或缺血性广泛性白质损害， 并且梗死灶区域对应神经系统症状、神经体征与血管性痴呆患病因素有必然因果性；患者及家属对该研究具体内容有知情权并签署知情同意书[8]。排除标准： 患有严重心、肾、肝等器质性病变或其他恶性病变者；严重焦虑、躁狂、抑郁症等心理疾病者；严重意识障碍，表达不清者[9]。

1.2 方法

1.2.1 问卷调查 设计环境流行病学调查表对受试者完成问卷调查答卷，调查表内容包括人口基本资料，研究组 100 例，男 64 例，女 36 例；年龄 45~76 岁，平均（60.82±11.65）岁。 患者自愿并同意在医生指导下按要求填写调查问卷表； 采用匿名调查问卷收集资料，并遵循保密原则。 问卷包括痴呆的严重程度、血管相关危险因素和个人生活饮食习惯、 气候气温气压等方面。

1.2.2 基因多态性检测 全血标本采集：所有患者清晨空腹未进食水， 采用枸橼酸钾抗凝管抽取静脉血5 mL， 目的是防止抽取的血液凝固和出现溶血现象影响结果，于-8℃冰箱冷冻保存，标本收集完成后，提取DNA，储存于低温下备用。

1.2.3 PCR 扩增 根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）提供的 TOMM40 基因序列，PCR 设计TOMM40基因引物：正向引物：5’-AGGAAGAGATGAGAGTTGGTGTG-3’，反向引物 ：5’-CTGGAGAAGAGAAACGCTGTC-3’。根据熔解曲线图挑选出不同基因型的样本进行PCR 扩增，并由上海生工生物工程股份有限公司合成基因。

1.2.4 温度及循环设置 PCR 反应条件 95℃预变性10 min 后进入主循环，95℃变性 30 s，60℃退火 30 s,72℃延伸60 s，共两个循环，退火温度每两个循环下降 2℃直至 55℃，95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸60 s，共40 个循环。

1.2.5 琼脂糖凝胶电泳法 将盛有20 mL TAE 的锥形瓶中加入0.3 g 琼脂糖，酒精灯加热1 min。等待液体变凉， 加入 2 μl EB 或 4 μl 核酸染料至锥形瓶中。 制胶板放入制胶电泳槽中，插入梳子。 将溶解的琼脂糖倒入其中至4~6 mm。 消除气泡。 室温下冷却至凝固。垂直拔出梳子避免空样完好无损。将胶版放入电泳槽内， 取 5 μl PCR 扩增产物加入 1 μl DNA loading，合计 7 μl。 将其加入样孔中。 使用 2000TM DNA Marker 5 μl 作为对照样本。连接电源打开电泳仪器开关。 调节电压在80~100 V，电泳时间约20 min完成。

1.2.6 实验室结果检测 检测血管痴呆患者和健康人的TOMM40 基因多态性位点的基因型、等位基因型和单倍体型分布的特征特定情况，得出结果。

1.3 统计方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，根据数据结果采用单因素和多因素非条件Logistic 分析相关性, 分析环境因素作为变量对血管性痴呆患者数据的影响值，釆用非条件Logistic 分析TOMM40基因位点与血管性痴呆患者数据的相关性， 分析基因-环境因素的交互作用数据结果用多因子降维法（GMDR），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管性痴呆患者环境因素多元线性回归分析

以环境因素为因变量，进行多元线性回归分析，以标准化回归系数判断自变量对因变量的影响相关性，经过分析发现生活饮食、气温气候是血管性痴呆患者的影响因素（P＜0.05）。 见表 1。

表1 血管性痴呆患者环境因素多元线性回归分析

2.2 TOMM40 的 Logistic 回归分析

Logistic 回归分析显示，TOMM40 的 rs2075650位点基因型分布与血管性痴呆发病风险相关（P<0.05），见表2。

表2 TOMM40 基因型分布与血管性痴呆发病风险的相关性

2.3 基因-环境因素的交互分析结果

TOMM40 基因交互作用的 GMDR 模型分析结果针对筛选的与生活习惯、 环境因素相关的因素在病例组和对照组的基因分型结果，采用GMDR 分析各 SNP 之间的交互作用关系，发现至少3 种模型与血管性痴呆的发病具有相关性（P＜0.05），见表 3。

表3 TOMM40 基因-环境因素交互分析

3 讨论

该研究结果显示， 以标准化回归系数判断自变量对因变量的影响，经过分析发现生活饮食、气温气候是血管性痴呆患者的影响因素（P＜0.05）。相关学者研究发现，中年患者在外用餐机会较多，生活饮食可能与职业压力和社交有关。 同时由于北方天气寒冷饮食习惯相比南方天气影响血管痴呆性疾病的相关性增加[10]。 证实血管痴呆性疾病与患者的生活饮食习惯和当地的气温气候的影响着密切关联。

TOMM40 基因是线粒体外膜转运酶40 基因，该基因定位于19ql3.2，是外膜转移酶(TOM)形成的聚合体，同样是蛋白进入线粒体入口的重要通道，最终形成的亚基基因因子，TOMM40 基因参与蛋白质导入线粒体的机制和原理过程不可缺少。 已证实线粒体为细胞的活性提供了能量物质， 线粒体的功能可以复制和表达DNA， 同时调控细胞核内的基因。TOMM40 表达异常将导致线粒体功能障碍， 组织中央自由基增多，造成脑组织损伤。目前国内外大量研究结果表明， 晚期阿尔茨海默病的发病因素与TOMM40 基因的 rs2075650 位点 poly-T 重复序列的长度具有密切的相关性[11-13]，与该研究结果一致。以往有研究报道证实，TOMM40 基因rs2075650 位点多态性研究结果与脑梗死的发生呈正相关性（OR=0.391，P＜0.05）。 与该研究结果一致，该文研究结果呈正相关（OR=0.687，P＜0.05）。提示以上位点可能改变基因功能， 并最终影响血管性痴呆的发生与发展。TOMM40 基因的表达异常结果，可以直接影响到线粒体蛋白质的输入输出功能， 从而引起细胞核编码蛋白质向线粒体转运作用受到阻碍， 无法正常工作，使其不能正常进入线粒体内，导致线粒体无法发挥正常作用，最终引发线粒体的功能出现障碍，无法正常工作，从而线粒体会产生更多的氧自由基，如此反复最终形成了恶性循环， 反复发作进而影响脑组织的正常生理功能[14-16]。 相关学者对TOMM40 多态性与LOAD 的关系研究对我国北方汉族人群中得到证实结论， 方法是分别检测了是 rs2075650、rs157580 和 rs11556503 个 SNP 位点，中国汉族人群的LOAD 发病机制中TOMM40 基因多态性密切相关起到十分重要的作用[17-18]。TOMM40 基因交互作用的GMDR 模型分析结果针对筛选的与生活习惯、环境因素相关的因素在病例组和对照组的基因分型结果， 采用GMDR 分析了各 SNP 之间的交互作用关系，认为血管性痴呆的发病至少有3 种LOAD 具有密切相关（P＜0.05），血管性痴呆患者的发病因素中Logistic 回归模型结合GMDR 模型能够全面分析基因和基因-环境之间的相互作用，起到十分重要的作用。 该研究同样采用GMDR 分析了各 SNP 之间的交互作用关系，发现至少3 种模型与血管性痴呆的发病具有相关性（P＜0.05）。

综上所述，为防范、早期诊断及及早治疗人类血管性痴呆这类复杂的疾病， 未来需要研究者不断改善GMDR 模型研究方法，探索新的研究方法，希望通过加大样本量增加到人群队列中， 研究得出血管性痴呆疾病的影响因素与基因和基因-环境因素息息相关，从而发现基因、基因和环境等多种因素因子与血管性痴呆疾病之间的相互关联性， 为下一步研究提供可靠依据。