丁酸梭菌对主要商业饲用益生菌抑制作用的研究

王绍斌，张海鹏，高映红，王 配，肖明霞，王乙茹，PHOUTHAPANE Vanhnaseng，程志斌*

（1.云南农业大学，昆明 650201；2.玉溪市红塔区动物卫生监督所，云南 玉溪 653100；3.昆明云岭广大种禽饲料有限公司，昆明 650200；4.达州职业技术学院，四川 达州 635001；5.老挝农林部畜牧与水产局，老挝 万象 6644）

自2020年7月1日我国饲料工业全面禁用以促生长为目的的药物饲料添加剂以来，单一及复合饲用益生菌“替抗”的应用效果与评估技术受到行业高度关注[1-3]。近年来，具有调控肠道菌群功效的饲用益生菌丁酸梭菌（Clostridium butyricum）成为行业关注的热点[4-6]。大量动物试验结果显示[7-13]，饲粮单一添加丁酸梭菌对肠道多种有害菌具有显著抑制作用，有助于畜禽生长性能的改善。据此，研发人员为进一步提升饲喂单一丁酸梭菌的应用效果，初步开展了丁酸梭菌与其他主要商业益生菌的复合益生菌产品研发。现有研究显示：仅有3篇动物饲养试验报道丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌[14-15]、地衣芽孢杆菌[16]的复合益生菌的饲喂效果优于单一饲用丁酸梭菌；相反，更多的饲养试验显示，与单一饲用丁酸梭菌比，丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌[17-18]、地衣芽孢杆菌[19]、凝结芽孢杆菌[20]或酿酒酵母[21]的复合益生菌，未能进一步改善动物生产性能。以上矛盾的饲养试验结果提示，排除试验动物、养殖条件、试验设计等因素的干扰，丁酸梭菌与其他商业益生菌可能存在拮抗效应。

鉴于动物饲养试验易受试验动物品种、日龄、养殖环境卫生条件、试验因素及处理组设计等干扰[3,22-23]，建立客观、标准的体外丁酸梭菌与其他商业益生菌复配效果的评估技术，有助于高效研发丁酸梭菌的复合益生菌产品。据此，本研究创新采用体外牛津杯抑菌试验法，探究丁酸梭菌对其他商业饲用益生菌可能的抑制作用，以便筛选出丁酸梭菌与其他商业饲用益生菌的复配方案，为稳定动物饲养试验结果、保障养殖应用效果提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 益生菌

丁酸梭菌，从云南西双版纳茶花鸡养殖场分离，经鉴定命名为丁酸梭菌YNAU 5738，用于本次抑菌性能试验评估。

本试验6个指示菌，包括凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulansATCC 7050）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisATCC PTA-6737）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformisbio-58806）、屎肠球菌（Enterococcus faeciumbio-67122）、粪肠球菌（Enterococcus faecalisBNCC192631）、 产 朊 假 丝 酵 母（Candida utiliBNCC336517），购买自北纳创联生物科技有限公司。

1.2 牛津杯抑菌试验

1.2.1 丁酸梭菌及指示菌的培养

（1）RCM 培养基：酵母膏3.0 g、牛肉膏10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、葡萄糖5.0 g、可溶性淀粉1.0 g、NaCl 5.0 g、三水合乙酸钠3.0 g、半胱氨酸盐酸盐0.5 g、蒸馏水1 000 mL。RCM 培养基厌氧培养丁酸梭菌24 h[24]。

（2）LB培养基：酵母膏5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、蒸馏水1 000 mL。LB培养基有氧培养枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌24 h[22]。

（3）MRS培养基：酵母膏10.0 g、蛋白胨20.0 g、NaCl 2.5 g、葡萄糖20.0 g、番茄汁50 mL、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁1.0 g、蒸馏水1 000 mL。MRS培养基有氧培养屎肠球菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母菌24 h[22]。

（4）凝结芽孢杆菌采用改良MRS培养基，参考柳成东等[25]的方法。

1.2.2 指示菌涂布平板制备

指示菌涂布平板采用MRS培养基，121 ℃灭菌30 min后冷却，至50 ℃左右倒入培养皿15～20 mL。凝固后待水分干燥即可涂布。

1.2.3 指示菌液稀释涂布

将以上培养24 h的6个指示菌的菌液，每个吸取800 μL，转入装有7.2 mL 无菌水的EP 管中，进行梯度稀释至10-3，涂布。每个指示菌涂3 个培养皿（3次平行测定）。

1.2.4 牛津杯抑菌测定

为了评估与比较丁酸梭菌对6个指示菌的抑菌作用及效果，每个指示菌吸取200 μL涂布1个培养皿，并在每个培养皿中放置1个牛津杯，在牛津杯加入200 μL 的丁酸梭菌菌液，随后置于恒温箱37.5 ℃培养。除凝结芽孢杆菌培养48 h 外，其余5 个指示菌均培养24 h。用游标卡尺测量抑菌圈直径（diameter of inhibition zone，DIZ）的最大值与最小值，以二者的平均值确定抑菌圈直径。

1.2.5 抑菌作用判定方法

当前丁酸梭菌抑菌作用尚无统一的判定标准，依据本次抑菌试验所测的抑菌直径数据，制定以下抑菌作用判定标准：不敏感，DIZ=7.8 mm；低敏感，7.8 mm＜DIZ≤10.0 mm；中敏感，10.0 mm＜DIZ≤12.0 mm；高敏感，DIZ＞12.0 mm。

1.3 统计方法

抑菌圈直径数据采用“平均值±标准差”表示。为了区分丁酸梭菌对不同指示菌的抑菌效果，对6 个指示菌之间的抑菌圈直径数据进行单因素方差分析和LSD 多重比较，P＜0.05 表示统计差异显著。依据显著性差异区分4个区间的抑菌作用判定标准。

2 结果与分析

试验结果表明，丁酸梭菌对凝结芽孢杆菌的抑制作用达到“高敏感”（DIZ＞12.0 mm），对地衣芽孢杆菌的抑制作用为“中敏感”（10.0 mm＜DIZ≤12.0 mm），对枯草芽孢杆菌的抑制作用为“低敏感”（7.8 mm＜DIZ≤10.0 mm），对屎肠球菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母的抑制作用均判定为“不敏感”（DIZ=7.8 mm）。见表1和图1。

表1 丁酸梭菌对6个商业饲用益生菌的抑菌圈直径（DIZ） mm

图1 丁酸梭菌对6个商业饲用益生菌的抑制作用

3 讨 论

我国农业农村部《饲料添加剂品种目录（2013）》列出了34 个在畜禽、水产饲料中允许应用的饲用益生菌[22,26]。除丁酸梭菌外，当前我国饲料工业中应用与推广较多的商业饲用益生菌包括凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、粪肠球菌及屎肠球菌[22]。目前，单一饲用丁酸梭菌改善畜禽、水产动物生产性能的研究已有大量报道[27-30]，但关于丁酸梭菌和其他商业益生菌复合饲用的研究较少，且饲养试验结果并不一致[14-21]。为了提高复合益生菌的研发效率及饲用效果的稳定性，本研究从体外抑菌试验着手，重点分析丁酸梭菌与其他6 个商业饲用益生菌之间可能存在的拮抗作用。

3.1 丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌具有拮抗效应

本研究结果显示，丁酸梭菌对凝结芽孢杆菌的抑制作用达到“高敏感”，表明丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌之间具有拮抗效应。目前，仅有的1篇文献对虹鳟鱼饲养试验的研究结果显示，单一饲喂7.35×106cfu·g-1（全价配合饲料）丁酸梭菌显著改善了虹鳟鱼增重和饲料转化率；然而，与单一丁酸梭菌组比，添加丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌的复合益生菌组（7.35×106cfu·g-1丁酸梭菌+2.40×106cfu·g-1凝结芽孢杆菌）反而使虹鳟鱼增重和饲料转化率略有降低，差异不显著[20]。由此可见，本研究体外试验结果验证了樊英等[20]的试验结果。此外，尽管樊英等[20]检测了虹鳟鱼肠道菌群“门”水平的数据，但该结果未能从“属”和“种”的水平验证生长性能的这一变化。综上分析，丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌之间具有拮抗效应，这有待于更多的饲养试验与肠道菌群分析数据支撑。

3.2 丁酸梭菌与地衣芽孢杆菌具有拮抗效应

本研究结果显示，丁酸梭菌对地衣芽孢杆菌的抑制作用为“中敏感”，表明丁酸梭菌与地衣芽孢杆菌之间具有拮抗效应。袁慧坤等[16]研究结果显示，单一饲喂5.0×105cfu·g-1丁酸梭菌显著改善了北京鸭生长性能；然而，与单一丁酸梭菌组比，添加丁酸梭菌与地衣芽孢杆菌的复合益生菌组（5.0×105cfu·g-1丁酸梭菌+1.0×106cfu·g-1地衣芽孢杆菌）肉鸭的平均日增重、平均日采食量、料重比等生长性能指标差异均不显著。尹会方等[19]在断奶仔猪上的研究结果显示，与丁酸梭菌组（4.0×105cfu·g-1丁酸梭菌）比，添加丁酸梭菌与地衣芽孢杆菌的复合益生菌组（4.0×105cfu·g-1丁酸梭菌+4.0×105cfu·g-1地衣芽孢杆菌）仔猪平均日增重显著增加，但平均日采食量和料重比差异均不显著。上述仅有的2篇饲养试验报道与本研究丁酸梭菌与地衣芽孢杆菌具有拮抗效应的结果基本相符。

3.3 丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌可能具有拮抗效应

本研究结果显示，丁酸梭菌对枯草芽孢杆菌的抑制作用为“低敏感”，表明丁酸梭菌与地衣芽孢杆菌之间可能具有拮抗效应。农斯伟等[17]采用广西黎村黄鸡研究显示，与丁酸梭菌组（2.9×105cfu·g-1丁酸梭菌）比，添加丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌的复合益生菌组（2.0×105cfu·g-1丁酸梭菌+5.5×105cfu·g-1枯草芽孢杆菌）黄鸡的平均日增重、平均日采食量、料重比和死淘率等生长性能指标均差异不显著。分析肠道菌群“属”水平数据发现：代表肠道有益菌的乳杆菌属细菌数量指标，复合益生菌组较单一丁酸梭菌组显著下降；代表肠道有害菌的另枝菌属细菌数量指标，复合益生菌组较单一丁酸梭菌组显著上升。于洁等[18]在扬州公鹅上的研究同样显示，与丁酸梭菌组（3.0×106cfu·g-1丁酸梭菌）比，添加丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌的复合益生菌组（3.0×106cfu·g-1丁酸梭菌+2.0×107cfu·g-1枯草芽孢杆菌）鹅的增重、采食量和料重比均差异不显著。由此可见，本研究体外试验结果验证了以上2个饲养试验的结果。

另外，孙玲玲等[14]研究显示，与单一丁酸梭菌组比，添加丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌的复合益生菌组的五龙鹅平均日增重显著增加，但平均日采食量和料重比差异不显著。何菊等[15]的研究结果显示，与单一丁酸梭菌组比，添加丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌的复合益生菌组肉鸡平均日增重显著增加，料重比差异也不显著。然而，何菊等[15]分析肉鸡肠道菌群数据却显示，与单一丁酸梭菌组比，复合益生菌组盲肠食糜有害菌大肠杆菌和沙门氏菌数量显著增加，有益菌乳酸杆菌和双歧杆菌数量显著降低。这一结果显然与以上报道的生长性能数据矛盾。

综合以上分析，本研究认为丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌可能具有拮抗效应。

3.4 丁酸梭菌与酵母菌、屎肠球菌、粪肠球菌之间无拮抗效应

本研究结果显示，丁酸梭菌对酵母菌的抑制作用为“不敏感”，表明丁酸梭菌与酵母菌之间无拮抗效应。目前，仅有的一篇关于肉鸡饲养试验的研究结果显示[21]：单一饲喂5.0×106cfu·g-1丁酸梭菌显著改善了肉鸡增重和饲料转化率；与单一丁酸梭菌组比，添加丁酸梭菌与酿酒酵母的复合益生菌组（2.5×106cfu·g-1丁酸梭菌+2.5×106cfu·g-1酿酒酵母）肉鸡各项生长性能指标未进一步改善。进一步分析肉鸡粪便菌群显示[21]，与单一丁酸梭菌组比，复合益生菌组粪便乳酸杆菌数量显著上升。这一结果提示丁酸梭菌对酵母菌无拮抗效应，可作为复合益生菌研究应用。

此外，本试验首次研究了丁酸梭菌对屎肠球菌、粪肠球菌的抑制作用，结果显示丁酸梭菌对屎肠球菌、粪肠球菌均无抑制作用，这表明丁酸梭菌与屎肠球菌、粪肠球菌之间无拮抗效应。诚然，这有待于动物饲养试验的进一步验证。

4 结 论

本研究采用体外牛津杯法评估了丁酸梭菌对6 个主要商业饲用益生菌的抑制作用，结果显示丁酸梭菌对凝结芽孢杆菌的抑制作用达到“高敏感”，对地衣芽孢杆菌的抑制作用为“中敏感”，对枯草芽孢杆菌的抑制作用为“低敏感”，对产朊假丝酵母、屎肠球菌、粪肠球菌的抑制作用均判定“不敏感”。以上结果提示，牛津杯法适合评估丁酸梭菌与其他商业益生菌之间存在的可能拮抗效应，这对复合益生菌的研发、筛选与应用具有科学指导意义。