2种冷冻时长进行液氮冷冻法犬股骨头坏死造模的效果比较

楼鹏强，邓小磊，魏波，汤朔，侯德才

(辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032)

股骨头坏死是骨科常见的难治性疾病[1]。建立有效的动物模型，对于探索股骨头坏死的发生机制和新的治疗方法均有重要意义。目前用于股骨坏死造模的实验动物和造模方法较多，其中以液氮冷冻法制备的犬股骨头坏死模型应用最为广泛[2-5]。但对于造模过程中液氮冷冻的最佳时长，目前尚未见到相关研究。因此，本研究选择文献报道的4 min[6]和8 min[7]2种冷冻时长进行了对比研究，现总结报告如下。

1 材料与仪器

1.1 试验动物SPF级健康成年雄性比格犬12只，年龄17～23个月，体质量10.1～12.2 kg。所有犬均购自沈阳康平实验动物研究所，实验动物许可证号SCXK(辽)2014-0003。所有犬均在面积3 m2的犬舍中单独饲养，允许自由活动。实验方案通过辽宁中医药大学附属医院动物实验伦理委员会批准(21000092019051)。

1.2 主要试剂硫酸阿托品注射液(安徽长江药业有限公司，国药准字H34021900)，盐酸塞拉嗪注射液(长沙拜特生物科技研究所有限公司，兽药字180121777)，舒泰50(法国维克，批号：83887902)，注射用头孢美唑钠(山东罗欣药业集团股份有限公司，国药准字H20103440)，戊巴比妥钠(德国默克，批号：W-20180223)，乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)脱钙液(北京索莱宝科技有限公司)，HE染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)。

1.3 主要设备GE-D8000 X线机，GE Signa 1.5T超导MRI系统，Nikon MODEL YS100生物显微镜。自制液氮冷冻装置，该装置由包纳股骨头、保护周围组织的工作套筒和引流液氮的导轨2部分组成；其中工作通道由去除针头端的5 mL注射器外套制成，导轨由去除针头端的5 mL注射器外套纵向剖开后制成；使用时将导轨插入工作通道内(图1)；使用前，将液氮冷冻装置于液氮中进行预冷；以上操作均在无菌条件下完成。

2 方 法

2.1 动物分组及造模将12只动物随机分为冷冻8 min组和冷冻4 min组，每组6只。按0.1 mL·kg-1肌肉注射硫酸阿托品注射液，以减少麻醉过程中动物呼吸道腺体分泌；15 min后，按0.05 mL·kg-1肌肉注射盐酸塞拉嗪注射液进行诱导麻醉；15 min后，按 0.05 mL·kg-1肌肉注射舒泰50，术中按0.025 mL·kg-1给药维持麻醉。麻醉成功后，消毒，剃除犬左髋部约10 cm×16 cm的毛发，以碘伏消毒后，铺无菌手术单及洞巾。以大转子为中心在股骨干前缘弧形切开，切口近端始于近背中线处，远端止于股骨近端1/3～1/2处。分离皮下组织，在股骨干前外侧找到股二头肌与股筋膜、阔筋膜张肌的结合部，沿着股二头肌前缘切开，将阔筋膜张肌切断。分离暴露“股三角区”(背侧为臀中肌、臀深肌,外侧为股外侧肌,内侧为股直肌)[8]，向后拉开臀中肌和股二头肌，向上拉开阔筋膜和阔筋膜张肌，部分分离臀中肌和股外侧肌的附着部。钝性分离关节囊上附着的脂肪，暴露关节囊。顺着股骨颈方向剪开关节囊，向远端分离，暴露股骨头。向外旋转股骨，用弯剪伸到关节囊内剪断圆韧带，将预制好的液氮冷冻装置套在股骨头上，用纱布包绕冷冻装置以保护周围组织。沿导轨缓慢注入液氮，2组分别持续冷冻4 min和8 min。冷冻结束后，以生理盐水复温3 min左右，以肉眼观察到的股骨头表面颜色从苍白恢复至接近冷冻前状态作为复温结束的标志。闭合关节囊，将分离的肌肉恢复至原位并逐层缝合，关闭切口，术区覆盖无菌敷料后送回犬舍。术后7 d内，每天按0.1 mL·kg-1肌肉注射头孢美唑钠。造模手术由2名有丰富髋关节手术经验的医生完成。

2.2 造模结果评价造模手术后观察并记录动物的饮食、活动、精神状态、切口愈合等一般情况。造模后9周，进行X线和MRI检查，并以MRI影像作为判断股骨头坏死的标准，即T1WI上股骨头出现线样低信号区或T2WI上股骨头出现“双线征”[9]。影像学检查结束后，按100 mg·kg-1静脉注射戊巴比妥钠处死动物，取出造模侧股骨头，观察股骨头表面软骨及股骨头塌陷情况。股骨头标本大体观察结束后，将股骨头样本置于10%多聚甲醛中固定2 d，以14%EDTA脱钙4周，石蜡包埋后冠状位切片，厚度3 μm，HE染色后在显微镜下观察。

3 结 果

3.1 一般情况至最终处死前，2组均无动物死亡。造模手术后2 d内，所有动物均开始出现饮食减少、精神萎靡、活动减少等表现。冷冻4 min组动物的上述表现均在1周内改善；冷冻8 min组动物的上述表现约在2周后逐步恢复正常，切口愈合缓慢，而且均出现了跛行现象。冷冻8 min组的1只动物在造模手术后第3天出现术区皮肤红肿，造模手术后1周时出现对应部位皮肤组织坏死及化脓，造模手术后4周时愈合。

3.2 影像学检查结果

3.2.1X线检查结果 冷冻8 min组动物造模侧股骨头均出现了不同程度的变化，如骨质硬化、关节间隙变窄，但变化不明显，且部分动物的股骨头出现了囊性变[图2(1)]；冷冻4 min组仅2只动物的股骨头出现了轻微的骨质硬化[图2(2)]。

白色箭头指示处显示关节间隙变窄;蓝色箭头指示处为骨质硬化区域;黄色箭头指示区域为囊性变。

3.2.2MRI检查结果 冷冻8 min组所有动物T2WI上均可见股骨头骨髓水肿和关节腔积液表现[图3(1)]，T1WI上均可见线样低信号[图3(2)]，均达到股骨头坏死标准；冷冻4 min组4只动物T2WI上可见股骨头骨髓水肿和关节腔积液表现，其余2只动物的T2WI上仅可见关节腔积液表现[图3(3)]，T1WI上均无明显改变[图3(4)]。

蓝色箭头指示处为骨髓水肿;白色箭头指示处为关节腔积液;黄色箭头指示处为线样低信号区域。

3.3 大体观察结果冷冻8 min组股骨头扁平、表面较粗糙，部分股骨头出现软骨裂纹，部分股骨头软骨磨损严重[图4(1)]；冷冻4 min组股骨头形态无明显改变，表面较光滑，仅部分动物的股骨头出现了软骨裂纹或轻微软骨磨损[图4(2)]。

黄色箭头指示处可见股骨头扁平;白色箭头指示处为软骨裂纹;红色箭头指示处为软骨磨损处。

3.4 病理学检查结果冷冻8 min组股骨头组织骨陷窝内大部分骨细胞核消失，同时可见骨小梁断裂[图5(1)]；冷冻4 min组股骨头组织大部分骨陷窝内可见骨细胞核，骨小梁完整[图5(2)]。冷冻8 min组股骨头组织空骨陷窝率高于冷冻4 min组[(20.21±2.6)%，(13.51±3.1)%，t=4.055，P=0.002]。

绿色箭头指示处为空骨陷窝;黄色箭头指示处为断裂的骨小梁;蓝色箭头指示处为含有细胞核的骨陷窝。

4 讨 论

目前，进行犬股骨头坏死造模的方法很多。激素法易导致犬出现全身并发症，且造模成功率较低[10]，因此较少应用。创伤法通过造成股骨基底部骨折，阻断股骨头血供诱导股骨头坏死，但造模手术操作困难，可重复性较差[11]。酒精法通过从股骨大转子向股骨头建立通道，并向股骨头内注射乙醇，以诱导股骨头坏死的发生，但该方法需破坏股骨头的结构，同时操作较为困难[12-13]。液氮冷冻法与人类股骨头坏死的病理生理学过程相似，而且具有较好的可重复性[14]。

股骨头局部经液氮冷冻后，骨细胞发生坏死，同时液氮冷冻也导致股骨头毛细血管内皮细胞受损、内外源性凝血机制激活，引起毛细血管微血栓形成，最终导致股骨头区域内小血管发生梗阻[15]。此外，液氮冷冻后，血管通透性增加，进而发生血液黏度增加、血液流速减缓等一系列变化，导致股骨头内静脉淤滞，骨内压增高，并加重股骨头内缺血。而股骨头复温后，血管再通，也可导致股骨头发生缺血性再灌注损伤[16]。

本研究中冷冻8 min组1只动物出现了术区皮肤坏死，这可能是液氮冷冻时间较长，导致周围皮肤组织冻伤所致。因此在进行液氮冷冻的操作时，应当注意保护好周围组织。我们在实验中用注射器制作的液氮冷冻装置，其工作通道的半径略大于犬股骨头的半径，正好容纳犬的股骨头，可以控制液氮冷冻的范围，同时以纱布包绕冷冻装置，很好地保护了周围组织。感染是髋关节手术中最严重的并发症之一。实验中使用的冷冻装置均在无菌条件下完成，从而有效避免了感染的发生。

本研究的结果提示，以液氮冷冻法进行犬股骨头坏死造模时，液氮冷冻8 min的造模成功率高于液氮冷冻4 min。