含二氧化钛的QuEChERS净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中15种糖皮质激素的残留量

王秀云

(福建省药品审核查验中心,福州 350000)

糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的一类具有甾体母核结构的类固醇类激素[1],具有强大而非特异性的抗炎、抑制免疫应答、抗休克、抗病毒、调节糖和脂肪代谢等药理作用[2]。糖皮质激素由于能显著提高饲料的转化率,起到促进生长的作用而被广泛添加,有的生产者为了追求经济效益可能会过量或非法添加[3],而过量的糖皮质激素会残留在动物体内,进而通过食物链威胁消费者的健康安全。研究表明,过量食用糖皮质激素会导致肥胖、骨质疏松、内分泌紊乱、消化系统异常等疾病[4]。

现有的国家标准与文献报道中检测糖皮质激素常用的前处理方法有固相萃取[5-7]、液液萃取[8]和QuEChERS等[9-11]。QuECh ERS 因快速、简便、安全、成本低等特点,被广泛应用于农兽药残留量的检测中。QuEChERS吸附剂的主要成分有N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基键合硅胶(C18)、无水硫酸镁和中性氧化铝等[12],可有效去除动物源性食品基质中的脂肪酸、糖类、酚类和一些大分子化合物,但是对磷脂的去除效果较差。而一些食品,如牛奶等中的磷脂会很大程度地影响目标化合物的离子化效果,进而影响方法的灵敏度和准确度。

钛离子或钛氧化物与具有磷酸基团或者含磷酸根的物质具有强的配位作用,常用于富集该类化合物[13-15]。鉴于此,本工作在传统Qu ECh ERS 吸附剂中加入二氧化钛纳米粒子,用于去除样品中的磷脂,结合超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLCMS/MS),同时测定了牛奶中15种糖皮质激素的含量。该方法可有效去除样品中的磷脂,降低基质干扰,提高方法的灵敏度和准确度,能够满足日常检测的需求,也可为其他磷脂含量高的动物源性食品中的兽药残留分析提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1290型超高效液相色谱仪;API 5500 型四极杆串联质谱仪;CR21N 型高速冷冻离心机;MS3型涡旋混合器;Milli-Q 型超纯水器。

单标准储备溶液:1.0 g·L－1,取各糖皮质激素标准品10 mg(精确到0.1 mg),用乙腈溶解并稀释至10 mL,于－20 ℃保存。

混合标准中间溶液:10 mg·L－1,各取1 mL上述单标准储备溶液于100 mL 容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,于－20 ℃保存。

曲安西龙标准品的纯度为99.64%;氢化可的松标准品的纯度为99.2%;泼尼松龙、乙酸氢化可的松标准品的纯度为99.5%;泼尼松标准品的纯度为99.6%;可的松标准品的纯度为97.2%;甲基泼尼松龙、布地奈德标准品的纯度为98.9%;倍他米松标准品的纯度为99.3%;氟米松、地塞米松、倍氯米松标准品的纯度为99.8%;曲安奈德标准品的纯度为98.8%;氟米龙标准品的纯度为97.90%;氯倍他索丙酸酯标准品的纯度为98.5%。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸和乙酸均为色谱纯;二氧化钛粉末粒径为200～400 nm;氯化钠为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱 温30 ℃;流 量0.25 mL·min－1;进样量5.0μL;流动相A 为0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液,B 为乙腈。梯度洗脱程序:0～2.0 min时,A 为70%;2.0～6.5 min时,A 由70%降至10%,保 持1.5 min;8.0～8.1 min 时,A 由10%跳转至70%,保持1.9 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源正离子(ESI＋)模式;喷雾电压5 500 V;离子源温度550 ℃;碰撞室入口电压10 V,碰撞室出口电压15 V;雾化气压力379.4 kPa,气帘气压力206.9 kPa,辅助气压力379.4 kPa;多反应监测(MRM)模式。其他质谱参数见表1,其中“*”为定量离子。

表1 15种糖皮质激素的质谱参数Tab.1 MS parameters of 15 glucocorticoids

1.3 试验方法

将牛奶样品摇匀,分取5.0 g(精确至0.01 g)置于50 mL 离心管中,加入10 mL 乙腈,涡旋提取2 min,加入1.0 g氯化钠进行盐析。取5 mL上清液,加入吸附剂(500 mg无水硫酸镁、50 mg PSA、50 mg C18及50 mg二氧化钛),高速涡旋1 min,以9 000 r·min－1转速离心5 min,取1 mL上清液,经0.22μm 滤膜过滤后进样测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

对流动相中常用有机相乙腈、甲醇,常用水相水、0.1%甲酸溶液、0.5%(体积分数,下同)甲酸溶液对目标化合物的分离效果进行比较。结果显示:相较于甲醇,用乙腈作为有机相时,多数目标化合物的峰形、响应和分离度更好;相较于水,用含有甲酸的水溶液作为水相时,目标化合物响应值更高,但是更高体积分数的甲酸溶液并没有进一步优化目标化合物的响应和峰形。因此,试验选择乙腈-0.1%甲酸溶液作流动相,所得色谱图见图1。

图1 15种糖皮质激素的MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatogram of the 15 glucocorticoids

2.2 质谱参数的选择

糖皮质激素在质谱中行为较为复杂,为确定最优质谱条件,本工作分别在正、负离子模式下考察目标化合物的响应情况,发现正离子模式下的响应和稳定性均较好。因此,试验选择采用正离子扫描模式。采用蠕动泵直接进样,将100μg·L－1混合标准溶液注入电喷雾离子源中,进行一级质谱全扫描,结合化合物的结构和相对分子质量,确定各个目标化合物的准分子离子峰,并优化去簇电压、离子源温度、脱溶剂气温度等质谱参数;开启碰撞气,优化碰撞能量和碰撞室出口及入口电压,获得的最佳质谱参数见表1。

2.3 提取溶剂的选择

糖皮质激素的极性较弱,在有机溶剂中的溶解度较好,根据其性质,本工作选择甲醇、乙腈、乙酸乙酯进行提取效率比较试验。结果表明:甲醇提取液中共提取物较多,且与牛奶中水相难以分层,基质效应明显;乙腈能够有效沉淀牛奶中的蛋白质,提取液比较澄清,且响应值较甲醇提取液的高;乙酸乙酯极性较小,提取效率比较低,需要多次富集浓缩,操作过程复杂。综合考虑,试验选择乙腈作为提取溶剂。

2.4 常用净化吸附剂的选择

在样品净化过程中,常被用作Qu ECh ERS 吸附剂的有无水硫酸镁、PSA、中性氧化铝、石墨化碳黑(GCB)、C18等。PSA 属于碱性填料,具有弱阴离子交换作用,能够有效去除脂肪酸、糖类、酚类等极性物质;GCB 对色素和甾醇类物质有极强吸附作用,主要用于去除植物提取液中的色素成分,但GCB对带有苯环的化合物具有一定吸附作用,不利于牛奶中目标化合物的提取;中性氧化铝对脂肪具有较好的吸附效果;具有长烷基链的C18能够吸附脂类、糖类等亲脂性杂质和一些大分子物质。由于牛奶样品的主要成分为水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖、无机盐等,为了获得较好的吸附效果,本试验选择以无水硫酸镁、PSA、C18作吸附剂。为优化各吸附剂的最佳用量,设计了三因素三水平正交试验,见表2。

表2 正交试验的各因素和水平Tab.2 Each factor and level of orthogonal experiment

根据正交试验结果,不同吸附剂对各目标化合物的影响程度不尽相同:对于地塞米松、曲安西龙、氟米龙、氟米松、倍他米松、乙酸氢化可的松,各吸附剂的影响程度为C18＞PSA＞无水硫酸镁,3种吸附剂的最佳组合为无水硫酸镁500 mg＋PSA 50 mg＋C18100 mg;对于甲基泼尼松龙、可的松、泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松,各吸附剂的影响程度为无水硫酸镁＞C18＞PSA,3种吸附剂最佳组合为无水硫酸镁1 000 mg＋PSA 50 mg＋C18100 mg;对于倍氯米松,各吸附剂的影响程度为PSA＞无水硫酸镁＞C18,3种吸附剂的最佳组合为无水硫酸镁500 mg＋PSA 50 mg＋C1850 mg;对曲安奈德,各吸附剂的影响程度为PSA＞无水硫酸钠镁＞C18,3种吸附剂的最佳组合为无水硫酸镁500 mg＋PSA 50 mg＋C18100 mg;对于氯倍他索丙酸酯,各吸附剂的影响程度为PSA＞C18＞无水硫酸镁,3种吸附剂的最佳组合为无水硫酸镁1 000 mg＋PSA 50 mg＋C1850 mg;对布地奈德,各吸附剂的影响程度为C18＞PSA＞无水硫酸镁,3种吸附剂的最佳组合为无水硫酸镁500 mg＋PSA 50 mg＋C1850 mg。综合考虑吸附剂对各个目标物的影响程度和净化效果,确定的最优组合为无水硫酸镁500 mg＋PSA 50 mg＋C1850 mg。

2.5 二氧化钛吸附剂用量的选择

为验证二氧化钛对样品中磷脂的去除效果,本工作取两组阴性牛奶样品(记为A 组和B组),分别加入1μg·kg－1糖皮质激素进行加标回收试验。比较了二氧化钛加入前(A 组)、后(B 组)15种糖皮质激素回收率的变化。结果表明,加入二氧化钛后,15种糖皮质激素的回收率有显著提升,由A 组的61.1%～79.1%提升到B组的85.6%～95.1%,说明添加二氧化钛可有效提高方法的准确度。

以加标阴性牛奶样品为待测对象(加标量为1μg·kg－1),进一步考察了二氧化钛用量(10,20,50,75,100,150 mg)对目标化合物回收率的影响,结果如图2所示。

图2 二氧化钛用量对15种糖皮质激素回收率的影响Fig.2 Effect of TiO2 amount on the recovery of the 15 glucocorticoids

由图2可知,随着二氧化钛用量的增加,目标化合物的回收率明显增加,当二氧化钛用量不小于20 mg时,目标化合物的回收率变化不大,说明牛奶样品中的磷脂已去除完全。考虑到动物源性样品中磷脂含量的差异性,试验选择二氧化钛吸附剂的用量为50 mg。

2.6 基质效应

参考文献[16],以相对响应值法进行基质效应的考察,即先按照仪器工作条件分析分别用溶剂乙腈及阴性样品溶液配制的混合标准溶液(基质匹配混合标准溶液),然后以基质匹配混合标准溶液、混合标准溶液中各目标化合物峰面积的比值与1的差值计算基质效应值。结果显示,目标化合物的基质效应值为－25.2%～－28.7%,说明存在基质抑制效应。考虑到试验成本及可操作性,本工作选择用基质匹配法消除基质效应。

2.7 标准曲线和检出限

用阴性样品溶液配制质量浓度为0.5,1.0,2.0,5.0,10,20,50μg·L－1的混合标准溶液系列并上机测定,以目标化合物定量离子的峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标进行线性拟合。结果显示:各目标化合物标准曲线的线性范围均为0.5～50μg·L－1,相关系数和线性回归方程见表3。

以不小于3倍信噪比的信号对应的质量浓度计算检出限,所得结果见表3。

由表3可知,15 种目标化合物标准曲线的相关系数均大于0.990 0,检出限为0.1～0.3μg·kg－1。

表3 线性回归方程、相关系数和检出限Tab.3 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.8 精密度和回收试验

对阴性牛奶样品进行1,2,10倍检出限的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表4。

由表4 可知,15 种目标化合物的回收率为89.7%～104%,测定值的RSD 为3.2%～12%。方法具有良好的回收率和较高的精密度,符合实际检测要求。

表4 精密度和回收试验结果(n=6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n=6)

表4(续)

2.9 样品分析

应用本方法对10批市售的牛奶样品进行分析,仅在1批牛奶样品中检出了微量氢化可的松,检出量为0.37μg·kg－1,而其他9批样品均未检出糖皮质激素。

本工作根据牛奶样品中磷脂含量高的特点,结合已有文献,在传统的QuEChERS 吸附剂中加入二氧化钛吸附剂来消除牛奶样品中的磷脂,并通过正交试验确定了各传统QuECh ERS吸附剂的种类及用量,通过对比试验确定二氧化钛的用量,为消除复杂基体的干扰,以基质匹配法进行定量,实现了牛奶中15种糖皮质激素的同时测定。本方法具有操作简便、灵敏度高、准确可靠等优点,有一定的应用推广价值。