BMP4 基因对合作猪绒毛生长发育的影响

李 娇 ，陈嘉璇 ，刘翁博洋 ，林上远 ，黄晓宇 ，2＊，滚双宝 ，2

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省现代养猪工程技术研究中心，甘肃 兰州 730070）

骨形态发生蛋白家族十分独特,可诱导IOPC类细胞向成骨细胞方向转化。研究表明，BMPs在造血组织、皮肤附属物等的形成和分化以及脂肪、肾脏、肝脏、骨骼及神经系统发育中起一定作用。BMP与胚胎发育过程中骨骼的发生有时空相连性，在胚胎发育的所有组织中均可检测到低水平BMP4基因mRNA表达。M.Menzies等研究表明，BMP4基因在胎羊毛囊不同发育阶段与Noggin基因共同参与了毛囊发育的调控，是细毛羊毛囊发育的关键决定因子。G.Thomadakis等、J.M.Wozney等研究表明，BMP4在毛囊发育时及毛球中合成角蛋白的表皮细胞中表达。通过观察表达BMP4基因的颉颃物Noggin的转基因小鼠，发现其毛发异常且形态发生改变。在绒山羊不同发育时期皮肤中的表达结果表明，BMP4基因在胚胎期上皮细胞、毛囊以及出生后毛囊生长兴盛期、退行期和休止期均有表达，表明其与毛囊形态发生以及出生后毛囊的发育、分化密切相关。目前，对BMP4基因与家畜皮肤毛囊关系的研究主要集中在绒山羊，尚未发现BMP4基因与猪毛囊发育方面的相关报道。本研究通过实时荧光定量PCR技术，检测BMP4基因在合作猪颈部、肩部、体侧、臀部皮肤的表达量，实验结果可为揭示BMP4基因对合作猪绒毛生长发育的调控机制提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

本实验选取冬、夏季两个季节合作猪的颈部、肩部、侧部、臀部四个部位皮肤样品，通过RT-qPCR方法检测BMP4基因在春、夏季合作猪皮肤中的基因表达量。具体的动物实验过程如下：

将1 2 头（冬、夏季各6 头）实验猪屠宰后快速采取皮肤组织，用PBS缓冲液清洗、标记后迅速置于液氮中冷冻，带回实验室转移至-8 0 ℃冰箱长期保存。实验所需合作猪由甘肃省现代养猪工程技术研究中心科研及人才培训基地—甘肃省甘南州迭部县尼傲乡蕨麻猪养殖专业合作社提供。

1.1.2 主要试剂、耗材

Trizol试剂，PrimeScript™II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，合作猪各组织的cDNA，BMP4基因的上下游引物、无酶水、内参等。

1.2 引物设计与合成

以GenBank中猪BMP4基因核苷酸序列（NM_001101031.20）和氨基酸序列（NP_001094501.1）为参考，采用NCBI中的Primer Premier 5.0，设计BMP4基因的荧光定量PCR特异性引物，合成引物，序列见表1。

表1 荧光定量PCR 引物设计

1.3 总RNA 提取和cDNA 合成

采用Trizol萃取法提取实验组和对照组合作猪颈部、肩部、体侧、臀部的组织的总RNA，并分别检测RNA完整性和纯度，将得到的cDNA保存在实验室-20℃的冰箱中。

1.4 实时荧光定量PCR

实时荧光定量反应：上下游引物各为0.8 μL，cDNA模板2 μL，内参均0.8 μL，sybr酶10 μL，RNase Free H2O补足至20 μL。反应条件为：95℃，5 min；94℃，30 s；61℃，30 s；72℃，1 min；35个循环。所有组织都做4个样品，每个样品同时做3个技术重复。以2-ΔΔCt法计算相对表达量，用SPSS 26.0软件进行数据分析，以平均数±标准差表示结果，最终结果通过Graphpad Prism 8.0以图片的形式展现出来。

1.5 生物信息学分析

从NCBI的GenBank数据库中下载获取各物种的BMP4基因的氨基酸序列：野猪（登录号：NP_001094501.1）、狗（登录号：NP_001274099.1)、家牛（登录号：NP_001039342.1）、野马（登录号：XP_023507423.1）、人（登录：NP_001193.2）、绵羊（登录号：NP_001103747.1）、鸡（登录号：NP_990568.4）、鼠（登录号：NP_001303289.1）、大猩猩（登录号：XP_004055236.1），猴（登录号：XP_012306449.1），兔（登录号：NP_001182652.1），用MEGA5.0软件进行序列比对、分析，采用表2工具进行BMP4基因的生物信息学分析。

表2 生物信息学分析软件工具

2 结果与分析

2.1 基因扩增曲线

通过图1可以得知，BMP4基因和内参基因在扩增时，指数期条带走向一致且清晰，由此说明cDNA的浓度合适，适应于采用该实验进行荧光定量分析。

图1 BMP4 基因和内参基因的扩增曲线

2.2 基因溶解曲线

通过图2可知，BMP4基因和内参基因的溶解曲线的多个重复均曲线一致性较好，没有多余的杂带出现，证明实验设计的引物良好，适合后续的实验分析。

图2 BMP4 基因和内参基因的溶解曲线

2.3 BMP4 基因在不同组织中的表达分析

采用qPCR检测合作猪各组织中BMP4基因的表达水平，发现冬季合作猪的颈部、肩部、侧部和臀部的BMP4基因的表达量显著高于夏季（P＜0.05）（表3和图3），这个结果说明BMP4基因有抑制毛囊生长发育的作用，提示BMP4基因影响合作猪绒毛生长发育。

表3 合作猪不同部位、不同季节BMP4 基因的表达量

2.4 系统进化树分析

利用MEGA5.0软件分析猪与狗、普通牛、人、绵羊、家鼠，鸡、大猩猩、野马、兔子和猴的核苷酸序列，制作出图4。由图4可知猪与牛、野马、绵羊亲缘关系较近，而与人、家鼠、猴和兔的遗传关系较远，该结果与动物分类相一致。

图4 BMP4 基因系统进化树结果图

2.5 蛋白理化性质分析

Prot Param 在线服务器分析结果显示，猪BMP4基因编码409个氨基酸，分子式为C2055H32221N620O597S16，等电点约为8.57，半衰期为30 h，如表4。

表4 合作猪BMP4 基因编码蛋白的氨基酸组成

2.6 蛋白亲疏水性分析

ExSyPA-ProtScale软件可用于氨基酸残基的亲疏水性预测，发现BMP4蛋白氨基酸残基的第307位赖氨酸亲水性是最强的，亲水值为-3.300；第14位半胱氨酸的疏水性最强，疏水值为+2.978；总平均亲水性为-0.565，平均值为负，说明猪BMP4蛋白可能为亲水性蛋白，如图5。

2.7 蛋白二级结构与三级结构预测

利用S O P M A软件和S w i s smodel软件对BMP4基因编码蛋白的二级结构和三级结构进行预测分析，结果显示：BMP4蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成（图6），其中α-螺旋占24.69%，无规则卷曲占比53.79%，β-转角所占比例为2.44%，这些二级结构单元进一步扭曲、折叠，形成了三级结构（见图7）。

图6 猪BMP4 基因编码蛋白二级结构预测

图7 猪BMP4 蛋白三级结构预测

2.8 信号肽剪切位点预测

运用SignalP软件预测，结果表明BMP4蛋白存在信号肽，且信号肽的剪切位点位于第24和25号氨基酸之间，如图8。

图8 猪BMP4 基因编码蛋白的信号肽位点预测

2.9 蛋白保守性预测

运用NCBI在线工具CDD预测保守结构域，结果显示猪BMP4蛋白含有两个超家族保守结构域，即TGFb-propeptide超家族和TGF-beta-SF超家族，其分别位于303～409位氨基酸残基与41～276位氨基酸残基（图9）。

图9 猪BMP4 蛋白保守结构域预测

注：*表示P＜0.05，差异显著

2.10 合作猪BMP4 基因编码蛋白亚细胞定位

采用PSORT II软件进行亚细胞定位。结果表明：BMP4基因编码蛋白有47.8%的可能性分布在细胞核，在细胞骨架、细胞质和高尔基体的可能性分别为13.0%、8.7%和4.3%。

3 讨论与结论

倪蓉研究表明，BMPs对动物生长发育、骨骼形成、创伤愈合、机体疾病等方面具有重要作用,且在毛囊发育过程中发挥调控作用。BMPs信号通路可诱导内源性Dsmoglein 4的表达,从而调控毛囊生长周期,维持毛发滤泡的稳定性,平衡毛发的自我增殖与凋亡。BMPs信号受阻会导致毛囊瘤的形成。M.Blessing等研究表明：BMP4主要会在成熟毛囊的毛乳头表达；若在转基因小鼠的毛囊外根鞘中过表达,就会抑制毛母质细胞增殖，激活外根鞘中毛角质蛋白基因表达，还会导致外根鞘及基质细胞增殖。顾华等研究表明，不同浓度的BMP4均可促进毛囊外根鞘细胞的增殖和迁移。毛干的分化是产生毛发的前提，若没有BMP4基因的参与，毛干分化受阻，毛发也不能形成。

为了研究BMP4基因对合作猪绒毛生长发育的影响，本实验对BMP4基因进行克隆、测序和生物信息学分析，结果表明：BMP4基因编码了409个氨基酸，半衰期为30 h，是一种亲水性蛋白，含有TGFb-propeptide超家族和TGF-beta-SF超家族保守结构域，没有跨膜结构域，存在信号肽位点。BMP4基因主要由α-螺旋（24.69%）、无规则卷曲（53.79%）和β-转角（2.44%）组成。系统进化树结果表明猪与马、牛、绵羊等亲缘关系较近，这与动物分类结果一致。这些结果可以为猪BMP4基因的相关研究提供参考。

注：Score0 表示疏水性；Score0 表示亲水性。

毛青青等研究表明，BMP4基因在毛囊和羽毛发生发育过程中表达且主要起负调控作用。对毛囊再生，BMP4起抑制作用。吴江鸿等发现，BMP4基因在绒山羊皮肤次级毛囊上表达效果不同，休止期高表达，兴盛期低表达，可调节山羊绒的周期性生长，推断BMP4基因可能参与调控毛囊发育，并在其中起抑制作用。

本文研究了猪BMP4基因的生物学特性，并检测夏季和冬季BMP4基因在合作猪猪体中的表达变化与合作猪周期性生长绒毛有关，冬季BMP4基因表达量高于夏季，初步推测：BMP4具有抑制毛囊生长发育的作用，当其表达量超过一定强度时就会抑制毛囊的生长发育，导致毛囊密度减少。本研究结果为探索合作猪绒毛生长调控分子机制和寻求育种与营养手段控制绒毛生长提供新的思路和方向，而且也将为毛发周期性生长调控机制提供理论依据。

（收稿日期：2022-03-14)