抑制线粒体钙单向转运体对大鼠急性胰腺炎氧化应激的作用研究*

覃颖颖，杨慧莹，吴青，谢金莲，蒙诺，雷宇，唐国都

（1.广西医科大学第一附属医院 消化内科，广西 南宁 530021；2.广西医科大学第二附属医院 消化内科，广西 南宁 530007；3.右江民族医学院第一附属医院 心血管内科，广西 百色 533000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是临床急腹症的常见病因，20%～30%可进展为重症[1]，且进展凶险， 预后差[2]。 线粒体钙单向转运体（mitochondrial calcium uniporter, MCU） 是新近鉴定的位于线粒体内膜的特异性钙离子通道，具有对钌红（ruthenium red, RR）敏感、可顺电化学梯度摄入Ca2+等特点[3]。胞内持续的钙离子浓度升高可能会导致严重的细胞事件[4]，引起细胞异常的代谢活动，最终导致细胞死亡[5-6]。氧自由基的参与是AP发病机制的重要环节，线粒体钙信号可作为机体氧化信号的调节器[7]。强化抗氧化效应时可以改善AP 的严重程度[8]，沉默信息调节因子3（silent information regulator 3, SIRT3）可通过多种途径抑制机体生成活性氧（reactive oxygen species, ROS）[9]。DONG 等[10]研究发现，线粒体腔内的ROS 可以作为MCU 半胱氨酸97 敏感的信号源，促进MCU 高阶低聚物形成，持续激活MCU 通道。本研究旨在探讨抑制MCU、减轻线粒体钙超载对AP 胰腺病理损伤和氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠8～12 周龄、体重210～250 g，购于广西医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（桂）2020-003，实验动物使用许可证号：SYXK（桂）2020-0004。大鼠在20～25℃空调房内饲养，通风良好，鼠笼定期清洁，自由进食、饮水。根据不同研究方法分为对照组、AP 组、AP+RR 组、RR 组，每组8 只。本研究经医院医学伦理委员会批准同意（No：2019-KY- 国基-017）。

1.2 主要试剂

雨蛙肽（上海Amquar 公司），Ⅳ型胶原酶、RR（美国Sigma公司），白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒（武汉华美生物科技有限公司），丙二醛（Malondialdehyde, MDA）、还原型谷胱甘肽（Glutathione, GSH）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司），DHE 荧光探针（北京普利莱公司），Fluo-4 AM Ca2+（美国Thermo Fisher 公司）、Rhod-2 AM Ca2+荧光探针（美国Invitrogen 公司），βactin、MCU、SIRT3 兔源单克隆抗体、羊抗兔二抗（美国CST 公司），MnSOD 抗体（英国Abcam 公司）。

1.3 主要仪器

红外线扫膜仪（美国Licor 公司），显微镜（日本Olympus 株式会社），多功能酶标仪（美国Thermo Fisher 公司），7600-120 型自动生化分析仪（日本HITACHI 株式会社），高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）。

1.4 方法

1.4.1AP诱导大鼠禁食12 h，称体重。对照组大鼠注射2.5 mg/kg 生理盐水，AP 组大鼠腹腔注射50 μg/kg 雨蛙肽，每次间隔1 h，注射7 次，复制AP 模型；AP+ RR 干预组大鼠腹腔注射2.5 mg/kg RR，20 min 后腹腔注射50 μ g/kg 雨蛙肽，RR 组大鼠注射等量2.5 mg/kg RR。

1.4.2血清淀粉酶（Amylase, Amy）、脂肪酶（Lipase）活性和IL-6表达量测定最后1 次注射雨蛙肽结束开始计时。模型复制24 h 后于大鼠腹主动脉穿刺取血，4℃静置30 min，3 500 r/min 离心10 min，取适量上清液，送至广西医科大学第一附属医院检验科检测血清Amy、Lipase 活性；采用ELISA 试剂盒检测血清IL-6 表达量，在多功能酶标仪450 nm 处读取吸光度值。

1.4.3胰腺组织病理学评分模型复制24 h 后留取大鼠胰腺组织，在4%多聚甲醛中固定24 h，脱水，石蜡包埋。选取包埋组织4 μm 厚切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色。显微镜下观察每张样本切片的5 个视野（×200）并评分，并取平均值，最终得分是每个病理参数的总和。胰腺组织病理学评分标准[11]见表1。

表1 胰腺组织病理学评分标准

1.4.4胰腺腺泡细胞线粒体超微结构观察取2 mm×2 mm×2 mm 主胰管组织，戊二醛中避光固定＞2 h，固定、脱水、渗透、包埋、切片、染色，电镜（×2 500、×8 000）下随机拍摄。

1.4.5腺泡细胞的提取及单细胞悬液的制备仔细切取主胰管周围胰腺组织，大小约2 mm×2 mm×2 mm，剪碎，37℃环境下与1 mg/mL Ⅳ型胶原酶孵育15～30 min 后终止消化，用70 μm、40 μm 细胞过滤器过滤，1 000 r/min 离心5 min，杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）洗2、3 次后重悬。

1.4.6腺泡细胞线粒体内Ca2+、细胞内游离Ca2+、ROS 浓度检测1 mL 腺泡单细胞悬液分别加入5 μmol/L Rhod-2 AM 和5 μmol/L Fluo-4 AM Ca2+探针工作液，按2∶3 体积在37℃黑暗中孵育30 min；1 mL 腺泡单细胞悬液和DHE 荧光探针按1 000∶1体积混匀，37℃避光孵育20 min。用D-PBS洗2、3 次后重悬，吸取500～800 μL 至35 mm×10 mm 细胞培养皿内，倒置荧光显微镜下观察线粒体内Ca2+、细胞内游离Ca2+、ROS 浓度，曝光时间分别为32 ms、195 ms、32 ms。每个实验重复3 次。

1.4.7胰腺组织GSH、MDA 含量的测定托盘天平称取适量胰腺组织，胰腺组织与冰生理盐水按重量（g）与体积（mL）1∶9 混合，冰浴后充分研磨，超声裂解5 s，制成组织匀浆，4 000 r/min离心5 min，取上清液，按GSH、MDA 试剂盒说明书测定。

1.4.8Western blotting 检测胰腺组织MCU、MnSOD、SIRT3 蛋白表达将蛋白样品与5×上样缓冲液（4∶1）混匀，煮沸5～10 min 备用。一抗稀释浓度为1∶1 000，荧光二抗稀释浓度为1∶10 000。转膜条件：150 mA，1 h。每个实验重复3 次。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 和GraphPad Prism 6.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠胰腺组织病理评分和血清Amy、Lipase、IL-6水平比较

各组大鼠胰腺HE 评分和血清Amy、Lipase、IL-6 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），AP 组较对照组高（P＜0.05），对照组与RR 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），AP+RR干预组与AP 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。血清Amy、Lipase、IL-6 水平和组织学变化表明AP 模型复制成功。见图1 和表2。

图1 各组大鼠胰腺组织HE染色情况 （×200）

表2 各组大鼠胰腺组织病理评分和血清Amy、Lipase、IL-6比较 （n=8，±s）

表2 各组大鼠胰腺组织病理评分和血清Amy、Lipase、IL-6比较 （n=8，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与AP组比较，P ＞0.05；③与对照组比较，P ＞0.05。

组别对照组AP组AP+RR干预组RR组F 值P 值血清IL-6/（pg/mL）8.653±0.478 10.326±1.238①9.724±0.341②8.668±0.328③11.909 0.000胰腺组织病理学评分0.200±0.283 4.150±0.463①3.750±0.499②0.325±0.545③173.932 0.000血清Amy/（u/L）862.000±223.671 1 442.444±206.201①1 405.556±235.323②1 058.000±86.226③15.571 0.000血清Lipase/（u/L）15.371±1.613 18.700±2.246①18.180±2.459②16.171±1.341③4.752 0.010

2.2 各组大鼠胰腺腺泡细胞超微结构

对照组、RR 组腺泡细胞整体结构尚可。AP 组腺泡细胞中度水肿，胞内局部电子密度减低，部分细胞器空泡变。细胞核呈不规则形，局部凹陷严重，异染色质边集，提示细胞凋亡，核仁较大；线粒体中度肿胀、基质变淡、嵴断裂、减少，少量严重者膜破损、基质外溢。AP+RR 组上述变化较AP 组减轻，腺泡细胞轻微水肿，细胞核偶见异染色质边集，核膜完整；线粒体轻微肿胀，形状、大小尚可，外膜模糊，嵴存在；余细胞器结构尚可。见图2。

图2 各组大鼠腺泡细胞超微结构的变化 （×8000）

2.3 各组大鼠MCU相对表达量，线粒体内Ca2+、细胞内游离Ca2+浓度比较

各组大鼠MCU 相对表达量，线粒体内Ca2+、细胞内游离Ca2+浓度比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），AP 组高于对照组、RR 组（P＜0.05），AP+RR 干预组低于AP 组（P＜0.05）。见图3～5 和表3。

图3 各组大鼠胰腺组织MCU蛋白的表达

图4 各组大鼠胰腺腺泡细胞线粒体内Ca2+荧光强度变化 （×200）

图5 各组大鼠腺泡细胞内游离Ca2+荧光强度变化 （×200）

表3 各组大鼠MCU相对表达量，线粒体内Ca2+、胞内游离Ca2+浓度比较 （n=8，±s）

表3 各组大鼠MCU相对表达量，线粒体内Ca2+、胞内游离Ca2+浓度比较 （n=8，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与AP 组比较，P ＜0.05；③与对照组比较，P ＞0.05。

胞内游离Ca2+1.719±0.011 1.864±0.131①1.700±0.052②1.724±0.008③3.419 0.043组别对照组AP组AP+RR干预组RR组F 值P 值MCU 0.373±0.108 0.990±0.113①0.354±0.100②0.356±0.0879③28.251 0.000线粒体内Ca2+1.657±0.010 1.951±0.019①1.669±0.018②1.659±0.003③331.314 0.000

2.4 各组大鼠胰腺组织MnSOD、SIRT3 表达量，GSH、MDA含量和ROS荧光强度比较

各组大鼠胰腺组织MnSOD、SIRT3 表达量，GSH、MDA 含量和ROS 荧光强度比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），AP 组MnSOD、SIRT3、GSH 低于对照组（P＜0.05），ROS、MDA 高于对照组（P＜0.05），AP+RR 干预组ROS、MDA 低于AP 组（P＜0.05），MnSOD、SIRT3、GSH 高于AP 组（P＜0.05）。见表4 和图6～7。

图6 各组大鼠腺泡细胞ROS荧光强度变化 （×200）

表4 各组大鼠胰腺组织MnSOD、SIRT3表达量，GSH、MDA含量和ROS荧光强度比较 （n=8，±s）

表4 各组大鼠胰腺组织MnSOD、SIRT3表达量，GSH、MDA含量和ROS荧光强度比较 （n=8，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与AP组比较，P ＜0.05；③与对照组比较，P ＞0.05。

组别对照组AP组AP+RR干预组RR组F 值P 值MDA/（nmoL/mg）2.162±0.608 4.023±0.651①2.548±0.453②2.181±0.464③30.035 0.000 MnSOD 2.031±0.453 0.912±0.123①1.844±0.383②1.946±0.462③5.582 0.023 SIRT3 0.565±0.170 0.272±0.078①0.475±0.117②0.562±0.176③2.856 0.015 ROS 1.709±0.013 1.810±0.001①1.704±0.011②1.719±0.009③82.071 0.000 GSH/（μmoL/g）133.409±24.631 79.768±17.762①114.165±22.680②132.007±45.283③4.862 0.009

图7 各组大鼠胰腺组织MnSOD、SIRT3蛋白的表达

3 讨论

MCU 参与了多项生物学作用，其中在神经系统、心血管系统和肿瘤性疾病研究较多[12-15]。MCU通过Calpain/OPA-1 等通路，影响线粒体通透性转换及稳态和线粒体分裂/融合的平衡，促进细胞凋亡，参与小鼠模型心肌缺血再灌注损伤和创伤性脑损伤[16-18]；MCU 上调线粒体Ca2+摄取，通过抑制NAD+/SIRT3/SOD2 通路和ROS 激活的c-jun 氨基末端激酶途径，促进基质金属蛋白酶-2 的活性[19]。激活ROS/NF-κB 信号，抑制转录因子A-线粒体磷酸化促进线粒体的生物发生[20]，促进肿瘤细胞的转移和体内外生长。线粒体是经MCU 运输的钙离子的接收器，线粒体钙离子信号异常会导致线粒体形态完整性发生变化。AP 起病过程中，腺泡细胞钙离子内流和氧化应激反应增强，线粒体形态以及结构的异常。而应用MCU 的抑制剂RR 后，可观察到腺泡细胞超微结构损害减轻，钙内流减弱，抗氧化效应增强。这为AP 钙超载、线粒体损伤、氧化应激提供了生化指标和形态学证据。

Western blotting 和荧光探针结果表明，在雨蛙肽诱导的AP 大鼠中，MCU 介导的氧化应激损伤导致氧化指标ROS 和MDA 水平上升，氧化保护因子MnSOD、GSH 水平下降。有趣的是，SIRT3 在MCU 介导的氧化应激损伤中也呈低表达，而当MCU 的作用被RR 抑制后，氧化应激水平下降，SIRT3 的蛋白表达水平上升，这提示SIRT3 可能是AP 氧化应激损伤的保护因素，MCU 的激活可能抑制了SIRT3 介导的相关通路，诱发氧化应激。MCU 的活化可以抑制肝癌细胞中的NAD+/SIRT3/SOD2 通路，促进肝癌细胞产生ROS，增强肝癌细胞的体外侵袭和迁移能力[17]，表明SIRT3 的活化可能抑制MCU 介导的ROS 水平，从而抑制氧化应激的发生、发展，与本研究结果相符。SIRT3 可能是治疗AP 氧化应激损伤的关键靶点。

不幸的是，抑制MCU 无法改善AP 的病理严重程度。这一结果与CHVANOV 等[21]结果是一致的。研究表明，线粒体钙超载并不是AP 诱导剂引起的唯一损伤效应，其可能仅参与腺泡细胞损伤和AP 启动的部分过程。即使是在MCU/CYD-D双基因敲除小鼠中，MCU基因完全缺失，实验动物的脑线粒体仍能摄取Ca2+[17]。DIA 等[22]发现，16 周的高脂肪高蔗糖（high-fat high-sucrose diet, HFHSD）喂养的小鼠出现胰岛素抵抗、糖尿病心肌病，在HFHSD 心肌细胞中观察到IP3R/Grp75/VDAC 钙通道复合体减少，IP3 刺激钙向线粒体的转运减少，但是MCU 及其调节亚基MICU1 并未参与到线粒体钙离子紊乱这一过程中，HFHSD 心肌细胞线粒体钙摄取减少主要是由于网状-线粒体功能性钙耦联减少所致。本研究发现抑制MCU 可能通过SIRT3/MnSOD 通路来抑制早期胰腺炎的氧化应激反应，但同样也显示了RR 并不能显著改善胰腺炎的病理严重程度。MCU 在AP 的发生、发展过程中的作用可能属于“微效”蛋白。然而在临床中，即使是轻症胰腺炎患者的恢复时间也需要1 周以上，AP 的临床治疗过程则更加漫长。有研究指出，在内皮细胞功能障碍中，高糖诱导的MCU相关的钙超载、凋亡和ROS 损伤的表现呈剂量和时间依赖性[23]，RR 在AP 的治疗后期仍有巨大的潜在价值。