流式细胞术检测精子线粒体膜电位影响因素分析*

李智新 沈嘉铭 徐 健 颜宏利** 李维杰

1.上海理工大学生物系统热科学研究所（上海 200093）；2.中国人民解放军海军军医大学第一附属医院（上海 200433）

线粒体是精子细胞内能量转换和新陈代谢的关键部位，参与精子超激活运动、获能、顶体反应、调节钙稳态、调控细胞凋亡等多种生理过程[1，2]。线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential,MMP）反映出线粒体内三羧酸循环的情况，是衡量其能量状态的指标[3]。精子MMP与其活力密切相关[4]，此外，MMP似乎与精子受精能力呈正相关，与DNA碎片呈负相关[5]。因此，检测精子MMP对评估男性生育能力以及精子发生的病理生理学研究具有重要意义。

目前，广泛使用商业化荧光探针如：JC-1（C25H27CL4IN4）检测MMP[6]，基本流程为：取一定量待测精液样本与JC-1单标试剂混匀，在37℃的CO2培养箱中避光孵育10分钟后，将样本上流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，应用荧光通道FL1（绿）和FL2（红）检测荧光强度，红色/绿色荧光强度比例降低代表线粒体去极化。由于在临床工作中实验室经常将样本集中起来一起检测，那精液样本放置时间和JC-1染色时间对精子MMP的结果有怎样的影响？精液冷藏以及添加样本保护剂能否降低时间对精子MMP的影响？相关研究极少。为此，本课题组对此进行了初步探讨，现报道如下。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

精子尾部中段染色试剂盒由浙江星博生物科技股份有限公司提供，葡萄糖、甘氨酸、HEPES等均购自Sigma公司（Sigma,America），精子冷冻保护液1067购于ORIGIO公司，所用仪器为BD Accuri C6流式细胞仪。检测精子MMP时，进样速度为低速，14μL/min，样本流直径10μm；……