Toll样受体7抑制剂的高通量筛选模型建立及应用

赵 越 郑祖国 周 萍 李 萍 刘志红

狼疮性肾炎(LN)是系统性红斑狼疮(SLE)最常见且最严重的并发症之一,也是造成SLE患者死亡的主要危险因素[1]。现有治疗方案对于难治性LN的完全缓解率仍然偏低,国家肾脏疾病临床医学研究中心在国际上首次提出“多靶点”的治疗理念并牵头组织完成了两项全国多中心随机对照临床研究(RCT),证实“多靶点”疗法(MT)疗效显著优于传统疗法[2-3],进一步探究疗效机制发现,MT可特异性抑制TLR7信号[4]。Toll样受体7(TLR7)是一类模式识别受体(PRRs),能够识别病毒来源或内源性的单链RNA(ssRNA),活化下游信号并诱发免疫炎症反应。既往研究证实TLR7通路异常活化在LN中发挥关键作用[5-6],TLR7表达上调可增加SLE发病风险[7-8],近期《Nature杂志》发表的工作证实TLR7单基因突变即可导致SLE发生[9]。以上结果强烈提示TLR7是LN药物研发的重要靶点,因此本研究构建高通量筛选(HTS)模型开展TLR7抑制剂筛选。既往文献已证实瑞喹莫德(R848)可作为配体活化TLR7[10]而羟氯喹(HCQ)能够抑制TLR7信号[11]。本研究利用R848激活TLR7,选择HCQ作为阳性药从140余种中药活性成分中筛选TLR7抑制剂并进行验证,研究结果将为LN药物研发提供重要依据与参考。

材料和方法

材料标准品来自中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室天然产物库。标准品溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,制备成储备液;雌性MRL/lpr小鼠和C57BL/6小鼠均购自江苏艾凌菲生物科技有限公司。

主要试剂葫芦素B(CuB,Sigma);RNA提取试剂盒(Takara);逆转录试剂盒(Takara);qPCR试剂盒(ABI);BCA蛋白定量试剂盒(碧云天);p-p65抗体(CST);p65抗体(Santa Cruze);髓样分化因子88(MyD88)抗体(CST)。……