圆柏叶挥发性成分夏初的日变化规律

路 通，田旭平

（山西农业大学 林学院，山西太谷 030801）

随着我国经济实力的提高，人们对健康生活的需求日益增长，生态文明建设成为我国未来发展的重点。在此背景下，以休闲娱乐、养生保健为主题的森林康养理念开始深入人心[1]。植物通过叶片或花等器官合成并释放挥发性有机物[2]（Volatile organic compounds，VOCs），该类物质有助于营造出负氧离子含量高和空气细菌含量低的森林空间。能释放VOCs 的树木是森林康养重要的保健资源[3]。植物VOCs 是一类次生代谢产物，包含萜类、醇类、酯类、醛类、酮类、烷烃类、芳香烃类和有机酸类等物质[4]。一定浓度的植物VOCs 具有杀菌消毒和抗病毒感染等作用，有助于人们镇静放松和提高人体免疫力等[5]，但浓度过高会使人产生紧张和焦虑等情绪[6]。

圆柏（Sabina chinensis）是中国传统园林绿化树种，其释放的VOCs 杀菌保健能力较强[7]。宁平等[8]发现，4 — 5月，圆柏一日内释放的VOCs 含量与温度呈显著正相关，24 ～35 ℃时VOCs 释放量最大。杨佳楠[9]发现，圆柏VOCs 成分中，烯烃类、烷烃类、酯类、醇类、酮类、醛类和酸类物质相对含量的日变化规律不同。盖苗苗[10]和高岩[6]分别采用顶空固相微萃取法（Headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和活体植物顶空套袋采集法对圆柏VOCs 的组成和释放规律进行研究，发现圆柏VOCs的主要成分为烷烃和萜烯类化合物，7月的释放强度最大。这些研究采用面积归一化法计算圆柏VOCs 成分的相对含量，叶内VOCs 成分含量的变化不清晰。植物VOCs 的成分及含量受温度、光照和空气湿度等环境和气候因素的影响，呈现年变化和日变化[11-12]。为了解晋中地区圆柏叶一日内VOCs成分和含量的变化规律，本研究采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-质谱联用技术（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对圆柏叶VOCs 成分和含量的动态变化进行研究，揭示和完善圆柏叶VOCs 夏初的日变化规律，丰富圆柏挥发物研究，为圆柏在森林康养中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料采自山西农业大学校园内（112°58′E，37°42′N）树龄相同、长势相似的3 株成年健康圆柏雌株。2021年5月中旬，选择晴朗无风的3天，7:00、10:00、13:00、16:00 和19:00 时，分别从3 株圆柏上剪取向阳面生长、约30 cm 长的枝条，采集枝条上完整的成熟刺叶，混合后检测。样品随采随测，当天每个时间点测1次，连续测3天。

参考国家气象科学数据共享服务平台（http://data.cma.cn/site/index.html）的数据信息，试验地5 个时间点的气温分别为（10 ± 2）、（13 ± 2）、（19 ± 2）、（25±2）和（17±2）℃。

1.2 试剂与仪器

色谱纯正己烷（C6H14，天津科密欧化学试剂有限公司）；色谱纯正十六烷（C16H34，上海源叶生物科技有限公司）。

Triplus RSH自动进样器；Trace 1300气相色谱仪；TraceISQ质谱分析仪（美国Thermo公司）；DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头（50/30µm，美国Supelco 公司）；TP-114电子天平（丹佛仪器（北京）有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 顶空固相微萃取法

称取0.5 g 混合圆柏刺叶，用超纯水将其冲洗干净并吸干水分，放入20 mL顶空进样瓶中，加入5µL正己烷稀释过的正十六烷内标溶液(10-4g/mL) ，旋紧瓶盖。萃取条件设置为50 ℃恒温，吸附时间40 min，平衡时间20 min，解析时间5 min。

1.3.2 气相色谱条件

色谱柱DA-5MS（30 m × 0.25 mm（ID）× 0.25µm）；程序升温为初始温度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 速率升温至150 ℃，保持5 min，以10 ℃/min速率升温至230 ℃，保持2 min；载气为高纯He（99.999%）；流速为1 mL/min；不分流进样；进样口温度为250 ℃。

1.3.3 质谱条件

传输线温度为280 ℃；EI 离子源温度为280 ℃；电子轰击能量为70 eV；全扫描范围为45 ～500 m/z；溶剂延迟时间为5 min。

1.4 数据处理

1.4.1 定性定量分析

采用NIST08谱库检索及人工图谱，根据匹配度和保留指数等进行解析，定性圆柏叶挥发物的组分。以正十六烷为内标物，采用单点内标法定量各组分的含量。计算公式为[13]：

Cx=C0×Sx/S0

式中，Cx为目标物含量（µg/g）；C0为内标物含量（µg/g）；Sx为目标物峰面积；S0为内标物峰面积。

1.4.2 统计与分析

采用Excel 2010 软件进行数据整理和作图；表中物质含量均为（平均值±标准误）。

2 结果与分析

2.1 圆柏叶VOCs成分及含量

共鉴定出67 种VOCs 成分，7:00、10:00、13:00、16:00 和19:00 分别鉴定出56、63、64、65 和61 种；10:00 ～16:00 种类较多，7:00 最少；相应各时间点萃取的VOCs总含量分别为6.901、13.033、11.081、8.960和5.570µg/g，随时间推移呈“单峰”曲线变化，10:00 时含量最高，19:00 时最低（表1 ～2）。鉴定出的VOCs 成分分别属于萜类、苯环类、醇类、酯类、酮类、醛类及酸酐类物质。5 个时间点萜类物质的数量均最多，含量均占VOCs总含量的88%以上；10:00时测出的VOCs 中，含量高于1µg/g 的萜类物质有3种，分别为桧烯、β-罗勒烯和L-乙酸龙脑酯，这些成分的含量之和占10:00 时VOCs 总含量的31.46%。苯环类物质含量在7:00、16:00和10:00时较高；醇类物质含量在10:00 和13:00 时较高；酯类物质含量在10:00时最高。同一样品体系中，萜类物质的数量和含量均占绝对优势，其他类型物质的含量随时间变化表现不一。

表1 圆柏叶VOCs各组分数量Tab.1 Numbers of VOCs in S.chinensis leaves

2.2 圆柏叶VOCs成分日动态变化

2.2.1 萜类物质含量日变化

各时间点萜类物质的总含量为5.209 ～11.599µg/g，10:00 时最高，呈“单峰”曲线变化，与VOCs 总含量的变化趋势一致（表2）。共鉴定出46种萜类物质，37 种在5 个时间点均被检测到（图1）。37 种物质中，含量呈“单峰”曲线变化的有24 种，分别为桧烯、β-罗勒烯、D-大根香叶烯、β-月桂烯、D-柠檬烯、δ-杜松烯、β-侧柏烯、γ-松油烯、(R)-α-蒎烯、石竹烯、γ-依兰油烯、α-毕橙茄油烯、α-异松油烯、γ-杜松烯、α-依兰油烯、β-毕橙茄油烯、（+）表双环倍半水芹烯、4-萜烯醇、3-甲基樟脑醇、龙脑、蛇麻烯、β-榄香烯、波斯菊萜和衣兰烯，与萜类物质总含量的变化趋势一致；含量呈“M”型曲线变化的有6 种，分别为L-乙酸龙脑酯、α-古巴烯、(S)-(-)-香茅酸甲酯、三环烯、莰烯和香叶酸甲酯，这些成分的含量分别在10:00 和16:00 时出现高峰；含量呈倒“N”型曲线变化的有4 种，分别为顺式-β-松油醇、左旋樟脑、α-松油醇和D-大根香叶醇，这些物质的含量7:00 ～10:00 时下降，10:00 ～13:00 时上升，13:00 时后下降；含量呈“V”型曲线变化的仅有β-波旁烯1种，含量从7:00 时开始下降，16:00 时最低，之后上升；含量呈“斜线”下降的仅有(-)-α-侧柏酮1 种，呈持续下降状态；含量呈“W”型曲线变化的仅有2,4-侧柏二烯1 种，含量分别在10:00 和16:00 时出现低谷，7:00、13:00 和19:00 时较高。9 种物质在5 个时间点没有被全部检测到；α-水芹烯仅在7:00 时被检测到；芳樟醇、顺式-3,5-依兰油二烯、胡椒酮、1,4-杜松二烯和β-衣兰烯这5 种物质在7:00 时未被检测到，其他时间点均被检测到；别罗勒烯在7:00 和19:00 时未被检测到，其他时间点均被检测到；α-法尼烯在13:00 和19:00 时未被检测到，其他时间点均被检测到；乙酸4-松油酯仅在16:00 和19:00 时被检测到；含量呈“单峰”曲线变化的有芳樟醇，呈下降趋势的有别罗勒烯、胡椒酮、1,4-杜松二烯和β-衣兰烯，呈倒“N”型曲线变化的有顺式-3,5-依兰油二烯。

表2 圆柏叶VOCs各组分的含量Tab.2 Contents of VOCs in S.chinensis leaves (μg/g)

图1 圆柏叶VOCs各萜类物质的含量Fig.1 Contents of terpenoids in VOCs of S.chinensis leaves

2.2.2 苯环类物质含量日变化

各时间点苯环类物质的总含量为0.139 ～0.301µg/g，呈倒“N”型曲线变化，7:00时最高，7:00 ～13:00时下降，13:00 ～16:00 时上升，19:00 时最低（表2）。共鉴定出5 种苯环类物质，仅对二甲苯在7:00 时未被检测到，其他4种物质在每个时间点均被检测到，表明苯环类物质为圆柏叶VOCs 的稳定成分（图2）。顺式-3-己烯醇苯甲酸酯和邻伞花烃的含量与苯环类物质总含量的变化趋势一致；邻甲氧基苯甲酸甲酯和对二甲苯的含量呈“单峰”型曲线变化；4-烯丙基苯甲醚呈“M”型曲线变化。5 种物质含量的变化曲线不一致。

图2 圆柏叶VOCs各苯环类物质的含量Fig.2 Contents of benzenes in VOCs of S.chinensis leaves

2.2.3 醇类物质含量日变化

各时间点醇类物质的总含量为0.102 ～0.211µg/g，10:00 时最高，呈“单峰”曲线变化，与VOCs 总含量的变化趋势一致（表2）。共鉴定出6 种醇类物质；顺-3-己烯-1-醇和1-辛烯-3-醇在5 个时间点均被检测到；2-壬醇在19:00 时未被检测到，其他时间点均被检测到；反式-4-(异丙基)-1-甲基环己-2-烯-1-醇在10:00 和13:00 时未被检测到，其他时间点均被检测到；3-己醇和2-己醇在7:00 和10:00 时未被检测到，其他时间点均被检测到；顺-3-己烯-1-醇和1-辛烯-3-醇含量均呈“单峰”曲线变化，与醇类物质总含量的变化趋势一致（图3）。

图3 圆柏叶VOCs各醇类物质的含量Fig.3 Contents of alcohols in VOCs of S.chinensis leaves

2.2.4 酯类物质含量日变化

各时间点酯类物质的总含量为0.084 ～0.707µg/g，呈“M”型曲线变化；7:00 ～10:00 时上升，10:00时达到最高值，10:00 ～13:00 时下降，13:00 ～16:00时上升，16:00 时出现第2 个小高峰，19:00 时最低（表2）。共鉴定出7 种酯类物质，这些物质在5 个时间点均被检测到，表明这7 种物质在圆柏叶的次生代谢过程中较稳定；2,4-葵二烯酸甲酯、己酸4-戊烯基酯、顺-3-己烯基丁酯和Z-3-甲基丁酸-3-己烯酯4 种物质的含量均呈“M”型曲线变化，与酯类物质总含量的变化趋势一致；3-甲基-3-烯基-2-甲基丁酸酯和丁酸，4-戊烯基酯的含量均在10:00 时最高，呈“单峰”曲线变化；癸酸甲酯的含量呈下降趋势（图4）。

图4 圆柏叶VOCs各酯类物质的含量Fig.4 Content of esters in VOCs of S.chinensis leaves

2.2.5 其他物质含量日变化

酮类、醛类和酸酐类物质各检测到1种；2-壬酮和癸醛在5 个时间点均被检测到，异丁酸酐在13:00和19:00 时未被检测到（表1）。各时间点2-壬酮的含量为0.008 ～0.077µg/g，10:00 时最高，19:00 时最低，呈“单峰”曲线变化；各时间点癸醛的含量为0.017 ～0.039 µg/g，10:00 和16:00 时较低，呈“W”型曲线变化。

3 讨论与结论

5 个时间点检测到的萜类物质数量和含量在各时间点圆柏叶VOCs 中均最高，与其他关于圆柏叶挥发性成分的研究结果一致[14-15]。高岩[6]和杨佳楠[9]采用活体植物顶空套袋采集法研究圆柏叶挥发物，本研究采用顶空固相微萃取法，虽然采样方法有差异，但对萜类物质成分及含量的分析具有一致性，表明在研究圆柏叶挥发物动态变化时，采用顶空固相微萃取法是可行的。与顶空套袋采集法相比，顶空固相微萃取法具有灵敏性高、重现性好、无需熔剂和容易定量等优点，更适合在近自然状态下对VOCs进行采集和分析[16]。

李娟等[17]和谢小洋等[18]发现，夏季针叶树VOCs浓度与日内温度和光照的变化呈显著相关；早上，随温度升高和光照增强，VOCs浓度升高；11:00 ～13:00时，温度和光照达到一天最大值，VOCs 释放浓度的峰值出现在中午前后，下午开始下降。本研究中，圆柏叶内VOCs 总含量的日变化也表现为“单峰”型，10:00 时出现高峰，11:00 ～13:00 时含量的具体变化，需在后续工作中进一步研究。本研究发现，萜类物质含量的变化趋势与圆柏叶VOCs 总含量一致，其数量及含量均占绝对优势，萜类物质的合成与代谢是影响圆柏叶VOCs 成分及含量的主要因素。影响植物合成和释放萜类物质的非生物因子主要有光照、温度、水分、营养、CO2浓度和空气湿度等[6]。光是植物生长发育的能量来源，在适宜范围内，光照增强有利于植物同化产物的积累，促进植物VOCs 的合成，提高VOCs 合成途径中相关萜类基因的表达量[19]。萜类物质的合成、积累与释放是通过一系列酶促反应表现的生理活动，适宜的温度可促进光合作用，提供碳源，增强代谢能力和关键酶的活性[20]。上午时，随温度升高和光照增强，植物的生理代谢逐渐增强，产生的萜类物质逐渐增多；但萜类物质合成后并未立即释放，而是暂时贮存在植物体内的特定结构中，直至贮存气体累积到一定量，贮存结构内部气压高于饱和蒸汽压时，通过开放的气孔大量释放出来[21-22]。本研究发现，7:00 ～10:00 时，圆柏叶内萜类物质的含量呈增长趋势，表明萜类物质合成后并未大量释放，而是一直处于积累状态；10:00时后，随温度继续升高，萜类物质的不断合成与积累使得贮存结构内部气压逐渐高于饱和蒸汽压，再加上气孔导度增大[23]，圆柏VOCs 的释放速率开始高于合成速率[24]，其叶内VOCs的含量逐渐下降。桧烯、β-罗勒烯和D-大根香叶烯等萜类物质的含量均在10:00 时随温度升高达到高峰，有些萜类物质没有遵循上述规律，可能与这些化合物的分子结构有关[25]。

植物VOCs 是由多种化合物组成的复杂混合物，化合物的组成和含量具有多样性、复杂性和时间上的动态性[26]，醇、酯、醛、酮和苯环类化合物的合成受外界环境的影响显著[2，27-28]，被释放到环境中的含量存在差异[29]，这些物质的合成与释放机理影响着VOCs的日变化规律，对其机理需进一步研究。

本研究采用固相微萃取法，每个时间点检测到的挥发物含量表示的是圆柏叶内储存的物质含量，其在环境中的释放效能受环境及化合物性质的影响，其释放到空气中多呈微量或痕量[17]，对本研究中检测到的微量及在某个时间点未被检测到的成分还需继续深入研究。