经自然腔道内镜手术微创保胆治疗胆囊炎患者围手术期肠道菌群的变化

邓立新，陈艺玲，吕新芝，唐庆林，刘将，温慧萍，温春虹，黄东，王淘淘，张鸣青

胆囊结石、胆囊良性息肉是临床常见的胆囊良性病变，近年来其发病率逐年升高。全球成年人胆囊结石总患病率已达10%～20%[1]。胆囊息肉在我国的患病率也逐年升高[2-5]。胆囊结石合并胆囊炎患者通常会因工作压力、饮食习惯等因素影响，使得病情更加严重，若不及时治疗则容易出现多种并发症，对患者的生命健康构成威胁。针对胆囊结石合并胆囊炎患者的治疗，传统方式是开腹胆囊切除术，虽然彻底解决了胆石症发作带来的痛苦，但胆囊缺失所带来的并发症，如消化不良、腹胀腹泻、十二指肠液的胃反流、胃液食管反流、胆管损伤、肝胆管结石、甚至增加结肠癌发生率等严重影响着患者术后的生活质量[6]。近年来，由张宝善教授倡导的内镜微创保胆手术(choledochoscopic gallbladder-preserving surgery，CGPS)日趋成熟，已经成为治疗胆囊良性疾病的手术方式之一[7]。CGPS是用软性(纤维)胆道镜进入胆囊内进行检查和治疗，纤维胆道镜既可以随意弯曲，又可以照明观察，哪里有结石就可以到达哪里取石，做到完全、彻底取净结石；此外，对怀疑有肝内外胆管结石或其它胆道疾患者，可经胆囊管纤维胆道镜检查并通过监视器得到其他术者的监视和帮助，获得病变的印象更为可靠[8]。与胆囊切除术相比，腹腔镜(laparoscope)保胆取石术具有保留胆囊生理功能、改善生活质量、避免胆汁反流、缓解因器官缺失而造成的精神压力等优点[9]，然而治疗胆囊结石的金标准依然为腹腔镜胆囊切除术[10]。除了腹腔镜胆囊切除术历史悠久，技术成熟外，归根到底，制约着CGPS难以广泛推广的原因在于，术后胆囊结石仍有一定的复发率[11]。

胆囊结石合并胆囊炎作为一种常见消化道疾病，由胆固醇代谢失衡(包括肠道吸收、肝脏合成、胆汁胆固醇输出及转化胆汁酸过程)引起[12]。其发病原理是胆固醇与胆汁酸浓度的比例发生变化，胆汁阻滞，形成结石[13]。由于肠道细菌在转化次级胆汁酸过程中扮演重要角色，可在一定程度上影响胆固醇与胆汁酸浓度的比例，推测肠道菌群紊乱与胆结石病之间可能存在某种关联性。

经自然腔道内镜手术(natural orifice transluminal endoscopic surgery，NOTES)是指不经腹壁切口，而经过人体自然腔道进入人体腔内进行内镜下操作和治疗的全新技术[14]。十年前中国消化界学者接受了NOTES 的概念并开展了一系列研究活动。李兆申、张澍田、李闻等率先开始NOTES 的动物实验，王东、朱惠明、刘冰熔等将NOTES 技术应用于临床工作，刘冰熔等相继报道了多例世界首创应用经胃NOTES 技术进行宫外孕切除术、卵巢囊肿剥离术、经胃或经直肠纯NOTES 保胆取石术及保胆息肉摘除术等[15]。NOTES 技术避免了腹壁切口，因此其预期的好处包括术后疼痛更轻、恢复期短、避免伤口感染和腹壁疝以及体表没有疤痕等，是继腹腔镜技术之后最重要的创新微创手术方式。由于该手术突破了消化道壁等传统的禁区，近年来一直是国内外学者关注的热点[16]。考虑到NOTES 与腹腔镜微创保胆手术两者在内镜使用和手术入路等方面存在许多差异，作为一项创新手术，其治疗价值尚存争议。本文结合患者围手术期的肝功能和肠道菌群的变化，为系统研究行NOTES微创保胆手术对胆囊炎患者肠道菌群的长期影响提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 研究对象

前瞻性纳入2018年1月至2018年7月联勤保障部队第九〇九医院消化内科住院需行内镜微创保胆治疗的胆囊炎患者29例，其中1例患者因测序后缺失术前粪便样品测序结果予以剔除。最终纳入患者28例，其中男性14例，女性14例；平均年龄(49.43±12.51)岁。经胃入路手术12例，经直肠入路手术15例，经脐入路手术1例；结石患者有14例：男性5例，女性9例；息肉患者有14例：男性9例，女性5例。总体上看，男性患者息肉比例相对较高，而女性患者结石病例相对较高(表1)。患者术前一般予以口服诺氟沙星和甲硝唑预防感染，手术过程予以左氧氟沙星冲洗腹腔，术后采用头孢类抗生素静脉连续滴注进行预防感染处理，术后均无严重并发症；术前术中术后均给予抗生素预防感染治疗患者有22例，术后给予抗感染治疗患者有6例。1例患者由直肠入路行NOTES手术取胆囊息肉，术后出现直肠穿孔并急性腹膜炎，给予复查肠镜并经肠镜再次给予一枚止血夹夹闭，采用腹腔排气机行腹腔灌洗以及左侧腹腔穿刺置中心静脉导管引流术，症状完全缓解后出院。

表1 患者一般资料

纳入标准：①持续或间歇性右上腹痛、腹胀；②超声/CT检查扫描可见强回声团或彩超提示胆囊息肉样变；③胆囊轮廓清晰，位置、大小正常，胆囊收缩功能良好；④心肺功能正常；⑤有明确保胆意愿。排除标准：①胆囊结石急性炎症发作期：如合并急性胆囊炎、急性胆管炎、胆源性胰腺炎；②胆囊已基本无功能，胆囊管闭塞，胆囊萎缩者；③胆囊恶性肿瘤患者；④不适宜进行无痛胃肠镜手术治疗的患者；⑤不同意进行微创保胆治疗的患者以及资料不全的可疑患者。本研究通过联勤保障部队第九〇九医院伦理委员会审批，批件号为2018-009-01；并已在中国临床注册试验中心注册，注册号为ChiCTR1900028267。

1.2 采样方法

所有受试对象对本实验的内容与性质均有明确认知，粪便样本采集均得到本人同意，采样程序符合医院伦理要求。术前由护士留取粪便一次，术后3～9 d内，再留取粪便一次。无菌条件下获取研究对象自然排出的新鲜粪便，避开表面，采集中心部分粪便样本2～5 g，置于已灭菌粪便收集管中，封口后置于冰盒暂存并带回实验室保存在-70 ℃冰箱。样品以干冰运输，委托上海慕柏生物医学科技有限公司以Illumina Miseq测序平台进行高通量测序。

1.3 样品Miseq测序分析

针对16S rRNA基因V3～V4可变区进行Miseq PE 2×300 bp高通量测序。采用物化法进行核酸提取，PCR扩增经预实验过程后，严格遵循：①样品浓度的均一性；②最低循环数的控制；③每例样品扩增循环数的统一。PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3～V4可变区，上下游引物为341F-805R。根据PE (Paired End) Reads之间互补区域，将配对的Reads拼接成一条序列，同时对Reads的质量和拼接的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的index序列和引物序列区分样品得到高质量的有效序列，并校正序列方向；所有样本的Illumina Miseq测序原始读数数据保存在欧洲分子生物实验室核苷酸档案数据库(PRJNA750235)。

1.4 操作单元聚类、注释与统计

利用Usearch算法(Usearch algorithm)将拼接好的序列聚类归类为操作单元(operational taxonomic unit, OTU)，软件平台为Usearch[17](version 11，http://drive5.com/uparse/)。对所有样品的有效序列，以97%的相似性(Identity) 将序列聚类成为OTU。Venn图用于统计多个样品中所共有和独有的OTU数目[18]。

1.5 α-多样性分析(α-diversity analysis)

多样性指数分析：根据OTU聚类分析结果，通过单样品的α多样性计算，可以估计物种丰度和多样性。计算菌群丰度的指数有Ace、Chao1；计算菌群的多样性指数有Simpson、Shannon；测序深度的指数有Coverage。分析软件为mothur[19](version v.1.30.1 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)，用于指数评估的OTU相似水平为97%。

稀释性曲线(rarefaction curve)[20]采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建rarefaction curve，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。因此，通过作稀释性曲线，可得出样品的测序深度情况。Shannon-Wiener曲线[21]使用97%相似度的OTU，利用mothur计算不同随机抽样下的shannon值，利用R软件作图。反映样品中微生物多样性的指数，利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样品在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。Rank-abundance曲线[22]构建方法是统计单一样品中，每一个OTU所含的序列数，将OTU按丰度(所含有的序列条数)由大到小等级排序，再以OTU等级为横坐标，以每个OTU中所含的序列数(也可用OTU中序列数的相对百分含量)为纵坐标做图。Rank-abundance曲线可用来解释多样性的两个方面，即物种丰度和物种均匀度。在水平方向，物种的丰度由曲线的宽度来反映，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线的形状(平滑程度)反映了样品中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀。Specaccum物种累积曲线(species accumulation curves)[23]是用于描述随着样品量的加大物种增加的状况，是调查样品的物种组成和预测样品中物种丰度的有效工具，在生物多样性和群落调查中，被广泛用于样品量是否充分的判断以及物种丰富度(species richness)的估计。

1.6 β-多样性分析(β-diversity analysis)

采用微生态定量分析流程(quantitative insights into microbial ecology，QIIME)，对测序结构进行β分析。使用R软件vegan软件包进行主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)并绘图。PCoA是一种降维排序方法，通过一系列特征值和特征向量排序从多维数据中提取出最主要的元素和结构[24]。基于Bray_curtis、Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac 距离分别来进行PCoA分析，并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图展示。如果样品距离越接近，表示物种组成结构越相似，因此群落结构相似度高的样品倾向于聚集在一起，群落差异很大的样品则会远远分开。

1.7 物种组成分析

采用RDP classifier贝叶斯算法[25]对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平：domain(域)，kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样品的群落组成。比对数据库为16S细菌和古菌核糖体数据库Silva[26]，置信度阈值为0.7。根据OTU注释结果分别在各个分类水平统计各样品的物种相对丰度并作图。

分组聚类热图展示总丰度排名靠前的物种在不同分组中的丰度，根据其在每个样品中的丰度信息，对物种进行聚类，绘制成热图，便于观察哪些物种在哪些样品中聚集较多或含量较低。

1.8 菌群结构差异分析

LEfSE(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=lefse_upload)根据分类学组成对样本按照不同的分组条件进行线型判别分析(LDA)，找出对样本划分产生显著性差异影响的群落或物种。

1.9 统计学分析

实验数据的统计处理使用软件SPSS 26.0；两组之间比较使用Mann-WhitneyU检验[27]，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 测序结果

本项目最终纳入有效样品56份，共获得1 133 017条高质量序列。经过 Mothur 软件拼接并除去引物，序列的平均长度为462 bp，长度分布在452～470 bp之间。术前获得的平均优化序列数为(20 719±292)条，术后获得的平均优化序列数为(19 746±513)条，结果表明术后与术前获得的优化序列数差异无统计学意义(t=1.584,P=0.125)。

2.2 OTU聚类、物种注释及统计

通过16S rRNA-V3区的深度测序，经97%相似性归并为术后与术前的测序覆盖深度(Coverage指数)均>0.99。对OTU进行α-多样性分析，56个样本的平均Reads为17 376；OTU平均值为130。聚类共获得524个OTU，归属15个门、27个纲、46个目、84个科、195个属。术前Reads指数17 274，略低于术后Reads指数17 478，但差异无统计学意义(t=0.414,P=0.682)。术前OTU为145.10±8.70，术后OTU为114.64±8.18，差异有统计学意义(t=3.539,P=0.001)(图1A)。VENN图(图1B)显示，术前独有OTU 78个，术后独有OTU 58个，共有OTU 388个。

2.3 α-多样性分析(α-Diversity Analysis)

Ace或Chao1越大说明菌群丰度越高，术前、术后的Ace分别是169.13±9.22和138.34±8.45(P=0.026)，Chao1分别为168.56±9.48和136.44±9.41(P=0.024)，差异有统计学意义(图1C、1D)。Shannon越大或Simpson越小表明群落多样性越强，术前和术后的Shannon值分别为3.05±0.16和2.53±0.13(P=0.002)，Simpson值分别为0.13±0.03和0.20±0.03(P=0.001)，差异有统计学意义。术后群落多样性显著低于术前，见图1E、1F。

图1 胆囊炎患者消化内镜下微创保胆治疗术前术后肠道菌群α多样性分析 A:实测OTU数；B:VENN图；C:ACE指数；D:Chao指数；E:Shannon指数；F:Simpson指数。术前(红色)；术后(蓝色)

图2A的稀释性曲线(Rarefaction curve)表明，随着样品测序深度的增加，观测物种指数曲线趋于平缓，说明当前测序深度足以发现各样本生境中的大部分物种。图2B的Shannon-Wiener曲线进一步表明，随着随机抽取的样品数据量增大，曲线趋向平坦，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。图2C反映物种丰富度及均匀度的Rank-Abundance曲线可以看出，随着OTU等级的增加，曲线愈加平坦并且在横轴的跨度也越来越大，说明样品中物种的均匀度和相对丰度都达到了很高的水平。图2D反映了持续抽样下新OTU(新物种)出现的速率, 当样品量在1～20，曲线显示急剧上升趋势，当样品量在20～30，曲线仍显示上升趋势，而当样品量大于30，曲线趋于平缓，则表示此环境中的物种并不会随样品数的增加而显著增多，本研究样品数为28，样品数基本充分，可以进行数据分析。

图2 α-多样性指数分析 A:稀释性曲线(Rarefaction curve)；B:Shannon-Wiener曲线；C:Rank-abundance曲线；D:Specaccum物种累积曲线

2.4 β-多样性分析(β-Diversity Analysis)

主坐标分析显示术后与术前区分良好。基于PCoA_bray_curtis距离：PC1解释率为42.83%，PC2解释率为20.11%；基于Unweighted_unifrac距离：PC1解释率为43.59%，PC2解释率为15.34%；基于Weighted_unifrac距离： PC1解释率为81.97%，PC2解释率为6.33%。均提示微创保胆治疗术前术后两个阶段的菌群能显著分开，且同一阶段的菌群聚集在一起，说明菌群结构有明显的区别，微创保胆取石治疗围手术期肠道菌群结构产生较明显的改变(图3)。

图3 消化内镜微创保胆治疗前后差异菌群主坐标分析 A:基于Bray_curtis距离; B:基于Unweighted_unifrac距离; C:基于Weighted_unifrac距离

2.5 物种组成分析

通过测序并利用 QIIME生成多样品物种丰度分布图(图4)。整体来看，所占比例最大的是拟杆菌门，其次是厚壁菌门和变形菌门，然后是放线菌门。以门水平上菌群结构差异为例，优势物种丰度图表明，术前和术后具有不同的菌群结构特征。术前拟杆菌门(P=0.023)、厚壁菌门(P=0.006)显著高出；术后变形菌门(P=0.002)、放线菌门(P=0.003)显著高出,差异有统计学意义。

图4 消化内镜微创保胆治疗前后肠道菌群门水平上多样品物种分布图

分组聚类热图(图5)显示优势物种OTU258(动胶菌属)、OTU408(链球菌属)、OTU167(葡萄球菌属)等在术后组中明显增加；OTU511(拟杆菌属)、OTU463(副杆菌属) 、OTU247(考拉杆菌属) 、OTU162(柔嫩梭菌属)等在术后组中明显减少。

图5 消化内镜微创保胆治疗前后差异关键菌群聚类热图

2.6 菌群结构差异分析

由于术前术后菌群丰度差异大，绘制LEfSe图时将LDA阈值设定为4.0。LEfSe法计算出术前和术后中的差异菌属，所有菌在门、纲、目、科、属水平的差异信息用饼形图表示，饼形图蓝色表示在术前中高出，红色表示在术后中高出，最内圈表示门水平的差异，依次往外的圈表示纲、目、科、属；扇形面积表示在此范围内的菌均有差异(图6A)。柱形图表示在手术前后中的差异菌属信息，蓝色表示在术前中高出，红色表示术后中高出(图6B)。

在纲的水平：拟杆菌纲、梭菌纲、厚壁菌纲在术前高出；放线菌纲、芽孢杆菌纲、α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲在术后高出；在目的水平：拟杆菌目、梭菌目、硒单胞菌目在术前高出；芽孢杆菌目、乳杆菌目、根瘤菌目、红环菌目在术后高出；在科水平：拟杆菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科、氨基酸球菌科在术前高出；葡萄球菌科、肠球菌科、链球菌科、生丝微菌科、红环菌科在术后高出；在属水平：拟杆菌属、副杆菌属、丹毒丝菌科未培养属；考拉杆菌属在术前高出；动胶菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、鹈鹕杆菌属在术后高出。

3 讨论

利用高通量测序技术研究肠道菌群，能够克服常规培养方法的缺陷，发现低丰度细菌或未知细菌，进而可全面、准确地获得菌群信息。血型、指印、虹膜扫描和DNA条形码是区分或识别人类个体的几种方法。根据Arumugam及其同事的说法，可以通过粪便中的微生物群落，即“肠型”来区分；以肠道内的细菌种类和数量划分，人类拥有三种肠型：拟杆菌型(bacteroides)、普雷奥氏菌型(prevotella)和瘤胃球菌型(ruminococcus)，用来反映各生态系统中的优势菌[28]。

成人肠道菌群的构成是相对稳定的，但也会受到某些因素影响，如肠道感染、饮食习惯、抗生素和益生菌的应用、手术、昼夜节律破坏等[29]。有研究认为，胆结石患者与健康对照组相比，肠道中属于变形菌门的细菌如大肠杆菌、沙门氏菌和螺杆菌属等水平较高；与此相反，粪杆菌属、毛螺菌属、罗斯伯里氏菌属处于较低水平[30]。本研究表明，患者术前拟杆菌属(Bacteroides)型显著高出。拟杆菌属(Bacteroides)是指革兰氏染色阴性、无芽孢、专性厌氧的小杆菌，能分解葡萄糖、乳糖和蔗糖，与肠道营养物质吸收密切相关[31]，提示患者术前更多地从碳水化合物和蛋白质中获取能量。而术后动胶菌属(Zoogloea)显著高出。动胶菌属(Zoogloea)属革兰氏染色阴性，专性好氧，化能异养，是废水生物处理中的重要细菌；动胶菌属丰度显著增加提示经NOTES术治疗后患者营养物质的分解加速。总体来看，慢性胆囊炎患者经NOTES保胆治疗，患者已经由“危”转“机”；肠道菌群方面，多样性和丰度显著下降，处于一个重建的过程。研究发现，一些耐抗生素的菌群如链球菌属、葡萄球菌属放线菌属丰度显著增加，可能与手术过程抗生素的使用有关；值得关注的是，一些低丰度菌属如噬胆菌属明显减少，推测术后胆囊胆汁淤积消除，肠道胆汁酸代谢恢复正常。

本研究样本数量相对较小，属单中心研究，是为不足之处。在条件允许的情况下，后期将加大样本量，进行多中心随机对照研究以充实本文结果。此外，后期也将密切关注患者术后三年以上的胆囊结石或息肉的复发率，以及胆囊结石或息肉复发与肠道菌群和胆汁酸谱变化之间的联系。

致谢：作者们感谢西京消化病医院聂勇战教授、孙丽娟博士在实验设计和论文修改过程所提供的宝贵意见！