经典名方易黄汤物质基准HPLC特征图谱的建立及量值传递研究

李华露,李秋桐,刘华兰,刘陶世,嵇晶,程建明,郭青

(1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;2.江苏省经典名方工程研究中心,江苏 南京 210023;3.江苏省食品药品监督检验研究院,江苏 南京 210019)

易黄汤是国家中医药管理局发布的首批100首古代经典名方目录之一,源自明末清初著名医家傅山所著《傅青主女科》,由山药(一两,炒)、芡实(一两,炒)、白果(十枚,碎)、黄柏(二钱,盐水炒)和车前子(一钱,酒炒)组成,具有固肾止带和清热祛湿的功效,是治疗妇科带下病的常用方[1]。方剂中山药、芡实专补任脉之虚,又能利水，为君药。白果收涩止带,兼除湿热,为臣药。用少量黄柏苦寒入肾,清热燥湿，车前子甘寒,清热利湿,均为佐药。诸药合用,重在补涩,辅以清利;健脾益肾,清热祛湿,则带下自愈[2]。易黄汤在临床上被广泛应用于治疗阴道炎、盆腔炎、宫颈炎等肾虚湿热型带下病[3-4]。

目前,关于易黄汤的研究多集中于药理及临床方面[5-6],关于其物质基准研究的报道较少。“经典名方物质基准”是经典名方复方制剂生产的化学基准和生物效应基准,其特征图谱及量值传递分析是物质基准质量研究的关键。易黄汤物质基准需遵循传统处方的组成和煎药方法进行制备,复方制剂易黄汤颗粒工艺的确定及质量标准制定依据皆来自“易黄汤物质基准”的研究[7]。易黄汤作为一个由5味药组成的中药复方,其质量控制及量值传递研究应以全方化学组成为研究重点,而目前对易黄汤的含量测定及量值传递研究仅涉及京尼平苷酸和盐酸小檗碱2个成分[8-9],其研究结果不足以达到对全方进行较好质控的要求。本研究在制备15批易黄汤物质基准的基础上,拟建立易黄汤物质基准的HPLC特征图谱和4种指标性成分(尿囊素、没食子酸、京尼平苷酸和小檗碱)的HPLC含量测定方法,并对4种成分在饮片-汤剂-物质基准的量值传递进行研究,为易黄汤物质基准的质量标准研究和易黄汤复方制剂的研发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

2 L陶瓷药罐(配套电炉底座FTS-10A功率武火500 W,文火200 W,壶福有限公司)、2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司);2998PDA型紫外检测器;FA1104型电子分析天平(上海天平仪器厂);YP20002型电子天平(上海越平学仪器有限公司);DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司);DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司);FW100型高速粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);YWLG-10型冻干机(南京研沃生物有限公司)。

1.2 试药

乙腈(色谱纯,德国Merck公司,批号：JA084630)、醋酸(色谱纯，美国Fisher公司,批号：104645)、甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司,批号：20200105)、水为自制超纯水。尿囊素(批号：111501-200202,纯度≥98%)、没食子酸(批号：110831-201605,纯度≥98%)、京尼平苷酸(批号：111828-201805,纯度98.1%)对照品均购自中国食品药品检定研究院;黄柏碱(批号：P11J9L65514,纯度≥98%)、小檗碱(批号：Y31J9H67024,纯度≥98%)对照品均购自上海源叶生物科技有限公司。

山药药材为薯蓣科植物薯蓣DioscoteaoppositeThunb.的干燥根茎;芡实药材为睡莲科植物芡EuryaleferoxSalisb.的干燥成熟种仁;白果药材为银杏科银杏属植物银杏GinkgobilobaL.的干燥成熟种子;车前子药材为车前科车前属植物车前PlantagoasiaticaL.的干燥成熟种子;黄柏药材为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮,上述药材经南京中医药大学巢建国教授鉴定,均符合2020年版《中国药典》相关药材的质量要求。

炒山药、炒芡实、炒白果、酒车前子和盐黄柏饮片均为自制,其炮制加工方法见表1。

表1 易黄汤饮片来源Table 1 Sources of Yihuang Decoction pieces

2020年版《中国药典》中仅载有车前子和盐车前子,因经典名方易黄汤中车前子规定为酒车前子,故为保证与原有药方同等功效,本研究按酒炙法炮制车前子。据文献报道[10],酒炙后,车前子中的京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量均较生品显著增加,在出膏率方面,酒炙车前子的出膏率也高于生车前子。

2 方法与结果

2.1 易黄汤15批物质基准的制备

按照课题组前期研究建立的易黄汤物质基准最佳制备工艺制备易黄汤物质基准,根据随机数表法对5味饮片进行随机组合及排序,15批易黄汤物质基准对应饮片的批号见表2。取炒白果粉碎过1号筛,酒车前子包煎,同其它饮片置于药罐中煎煮2次,第1次加8倍量水,浸泡30 min,加盖煎煮30 min;第2次取药渣再加7倍量水煎煮25 min,趁热滤过。合并2次滤液减压浓缩至生药含量为1.0 g·mL-1，冷冻干燥48 h,将得到的冻干粉密封于20 mL棕色西林瓶中,即分别得到15批易黄汤物质基准所对应实物。

表2 易黄汤15批物质基准对应的饮片批次Table 2 15 batches of Yihuang Decoction substance benchmark corresponding to the batches of decoction pieces

2.2 易黄汤物质基准HPLC特征图谱的建立

2.2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以0.1%乙酸水为流动相A,乙腈为流动相B,梯度洗脱:0～10 min，2%B；10～15 min，2%～3%B；15～25 min，3%～10%B；25～35 min，10%～18%B；35～46 min，18%～28%B；46～60 min，28%～65%B；60～63 min，65%～95%B；63～64 min，2%B；64～70 min，2%B。检测波长:0～6.5 min，205 nm;6.5～25 min，280 nm;25～35 min，254 nm;35～70 min，280 nm。流速0.5 mL·min-1;柱温25 ℃;进样量10 μL。特征图谱见图1。

2.2.2 供试品及对照品溶液的制备

2.2.2.1 物质基准供试品溶液的制备 取易黄汤物质基准冻干粉约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入15%甲醇50 mL,称定质量,超声60 min(功率250 W,频率40 kHz),放冷,再称定质量,用15%甲醇补足失质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.2.2 单味饮片和阴性对照供试品溶液的制备 分别称取处方量的炒山药、炒芡实、炒白果、酒车前子、盐黄柏5味饮片,按2.1项下易黄汤物质基准制备工艺和2.2.2.1项下的处理方法,得单味饮片供试品溶液;同法按处方量分别制备缺炒山药、缺炒芡实、缺炒白果、缺酒车前子、缺盐黄柏的5个阴性对照供试品溶液。

2.2.2.3 对照品溶液的制备 称定尿囊素、没食子酸、京尼平苷酸、黄柏碱、小檗碱适量,置于棕色容量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,作为对照品溶液。

2.2.3 特征图谱方法学考察

2.2.3.1 精密度考察 取易黄汤物质基准冻干粉,按2.2.2.1项下方法制备一份供试品溶液,按2.2.1项下色谱条件,连续进样6次。特征图谱相似度>0.98;特征峰的相对保留时间RSD均小于0.61%,相对峰面积RSD均小于4.31%,表明仪器的精密度良好。

2.2.3.2 重复性考察 取易黄汤物质基准冻干粉,制备供试品溶液6份,进样分析,特征图谱相似度>0.96;特征峰的相对保留时间RSD均小于0.12%,相对峰面积RSD均小于1.25%,表明方法的重复性良好。

2.2.3.3 稳定性考察 取易黄汤物质基准冻干粉,制备供试品溶液1份,分别于样品制备后0、2、4、8、12、24 h进样,特征图谱相似度>0.93;特征峰的相对保留时间RSD均小于0.21%,相对峰面积RSD均小于4.42%,表明样品的稳定性良好。

2.2.4 易黄汤15批物质基准的对照特征图谱及其相似度评价 将样品所得色谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)软件进行分析,对照图谱采用中位数法生成,使用多点校正对色谱峰进行匹配,生成全谱峰匹配图。供试品特征图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相对应的色谱峰。其中与参照物峰(峰6，京尼平苷酸)保留时间对应的峰为S峰,分别在相对保留时间为0.161(峰1)、0.206(峰2,尿囊素)、0.444(峰3)、0.743(峰4,没食子酸)、0.932(峰5)、1.000(峰6,京尼平苷酸)、1.314(峰7,黄柏碱)、1.332(峰8)、1.383(峰9)、1.402(峰10)、1.460(峰11)、1.485(峰12)、1.671(峰13)、1.688(峰14)、1.991(峰15,小檗碱)左右处呈现15个共有峰,见图1。

15批易黄汤物质基准的特征图谱见图1,特征图谱全谱图相似度结果见表3。从结果可知,15批易黄汤物质基准的特征图谱相似度>0.96,表明易黄汤物质基准的制备工艺稳定,不同批次间的差异较小。

表3 易黄汤15批物质基准特征图谱的相似度Table 3 The similarity of 15 batches of Yihuang Decoction substance benchmark

通过分别将5种单味饮片样品、缺单味饮片阴性样品和全方物质基准样品特征图谱各拟合出1张对照图谱,对易黄汤物质基准特征图谱共有峰进行色谱峰归属,见图2。通过比对单味饮片样品、缺单味饮片的阴性样品和全方物质基准对照图谱,发现单味药的特征峰均可传递到全方物质基准的对照谱图中。物质基准中峰1、峰2、峰3、峰5归属于炒山药;峰4归属于炒芡实;峰6归属于酒车前子;峰8、峰10归属于炒白果;峰7、峰9、峰11、峰12、峰13、峰14、峰15归属于盐黄柏。

2.3 易黄汤中4种指标性成分的转移率及含量测定

按2020版《中国药典》一部含量测定方法[11]测定酒车前子中京尼平苷酸、盐黄柏中小檗碱的含量；山药中尿囊素和芡实中没食子酸的含量测定方法如下。

2.3.1 色谱条件

2.3.1.1 HPLC法测定炒山药饮片中尿囊素的含量 Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以纯水为流动相A,以甲醇-乙腈(1∶1)为流动相B,梯度洗脱:0～15 min,2%～4%B;15～22 min,4%～5%B;22～25 min,5%～15%B;25～30 min,15%～35%B;30～40 min,35%～60%B;40～45 min,60%～90%B;检测波长:205 nm；流速:0.8 mL·min-1;柱温:25 ℃;进样量:10 μL。

2.3.1.2 HPLC法测定炒芡实饮片中没食子酸的含量 Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以0.1%乙酸水为流动相A,以乙腈为流动相B,梯度洗脱:0～15 min,2%～10%B;15～20 min,10%～15%B;20～25 min,15%～28%B;25～40 min,28%～65%B;40～45 min,65%～95%B;检测波长:280 nm；流速:0.5 mL·min-1;柱温:28 ℃;进样量:10 μL。

2.3.1.3 HPLC法测定易黄汤水煎液和物质基准中4种指标性成分含量 Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以0.1%乙酸水为流动相A,乙腈为流动相B,梯度洗脱:0～10 min，2%B；10～15 min，2%～3%B；15～25 min，3%～10%B；25～35 min，10%～18%B；35～46 min，18%～28%B；46～60 min，28%～65%B；60～63 min，65%～95%B；63～64 min，2%B；64～70 min，2%B。检测波长分别为205 nm(尿囊素)、254 nm(京尼平苷酸)、280 nm(没食子酸、小檗碱)。流速0.5 mL·min-1;柱温25 ℃;进样量10 μL。各图谱见图3。

注:2.尿囊素;4.没食子酸;6.京尼平苷酸;7.黄柏碱;15.小檗碱图1 混合对照品HPLC图(A)及15批易黄汤物质基准HPLC特征图谱(B)Fig.1 HPLC of mixed control solution (A) and characteristic chromatogram of 15 batches of Yihuang Decoction substance benchmark (B)

注：A.炒山药单味样品;B.炒芡实单味样品;C.炒白果单味样品;D.酒车前子单味样品;E.盐黄柏单味样品;F.缺炒山药阴性样品;G.缺炒芡实阴性样品;H.缺炒白果阴性样品;I.缺酒车前子阴性样品;J.缺盐黄柏阴性样品;K.易黄汤全方样品图2 易黄汤专属性考察HPLC图Fig.2 HPLC chromatogram of Yihuang Decoction for specific investigation

注：A.混合对照品;B.205 nm;C.254 nm;D.280 nm;2.尿囊素;4.没食子酸;6.京尼平苷酸;15.小檗碱图3 易黄汤物质基准中4种成分HPLC图Fig.3 HPLC chromatograms of four ingredients of Yihuang Decoction substance benchmark

2.3.2 供试品及对照品溶液的制备

2.3.2.1 对照品溶液的制备 取尿囊素、没食子酸、京尼平苷酸、小檗碱对照品适量,精密称定,加50%甲醇制成质量浓度分别为1.092、0.802、1.036、1.132 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3.2.2 单味饮片供试品溶液的制备 炒山药:取本品粉末(过3号筛)约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入15%甲醇50 mL,称定质量,超声60 min(功率250 W,频率40 kHz),放冷,再称定质量,用15%甲醇补足失质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

炒芡实:取本品粉末(过3号筛)约1 g,精密称定,置圆底烧瓶中,精密加入纯水100 mL,称定质量,加热回流2 h,放冷,再称定质量,用纯水补足失质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

酒车前子和盐黄柏供试品的制备方法同《中国药典》对应的含量测定项下[11]。

2.3.2.3 水煎液和物质基准供试品溶液的制备 水煎液供试品溶液的制备：精密吸取水煎液5 mL于10 mL容量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,静置30 min,10 000 r·min-1离心10 min,取上清液过0.45 μm微孔滤膜,即得。

物质基准供试品溶液的制备：同2.2.2.1项。

2.3.3 指标性成分含量测定的方法学考察 京尼平苷酸和毛蕊花糖苷均为2020年版《中国药典》中车前子药材含量测定的指标,但据文献报道[12],车前子在煎煮过程中,毛蕊花糖苷会部分转化为异毛蕊花糖苷,而京尼平苷酸则相对稳定。同时京尼平苷酸作为环烯醚萜类化合物,是车前子的主要有效成分。另外由于京尼平苷酸和毛蕊花糖苷溶解性的差异,中药水煎剂中京尼平苷酸的溶出相对较多,故综上选择京尼平苷酸作为含量测定的指标。

根据2.2.1项下色谱条件建立易黄汤物质基准中尿囊素、没食子酸、京尼平苷酸和小檗碱的含量测定方法,方法学考察内容及结果见表4。结果显示易黄汤物质基准中尿囊素、没食子酸、京尼平苷酸及小檗碱含量测定方法专属性、线性、仪器精密度、方法重复性、样品稳定性及方法加样回收率均良好。

表4 含量测定方法学考察结果(%，n=6)Table 4 Assay methodology (%，n=6)

2.3.4 浸膏转移率 按2.1项下的制备方法制备15批易黄汤水煎液,精密吸取50 mL于100 mL恒质量后的蒸发皿中,水浴加热成稠膏,真空干燥48 h以上至恒质量,称质量,计算15批易黄汤的出膏率。水煎液出膏率=mx/M×100%。mx为干膏粉质量,M为投料的饮片质量。按2.1项下的制备方法制备15批易黄汤物质基准冻干粉,将所得干粉进行称质量,计算每批物质基准的干粉收得率。干粉收得率=my/M×100%。my为干粉质量,M为投料的饮片质量。浸膏转移率=干粉收得率/水煎液出膏率×100%。

2.3.5 易黄汤15批物质基准指标成分含量测定及量值传递关系研究 按照2.3项下方法对炒山药、炒芡实、酒车前子、盐黄柏、15批易黄汤水煎液及物质基准进行4种指标性成分的含量测定,含量测定结果见表5～7,计算从饮片到水煎液和从水煎液到物质基准冻干粉之间指标性成分的转移率,转移率结果见表8～9。其中饮片到水煎液转移率=m2/m1×100%;水煎液到物质基准转移率=m3/m2×100%。其中m1为饮片中指标性成分的总含量;m2为水煎液中指标性成分的总含量;m3为冻干粉中指标性成分的总含量。

表5 饮片中指标性成分的含量(%,n=2)Table 5 Content of index components in decoction pieces (%,n=2)

表6 水煎液中指标性成分的含量及出膏率(%,n=2)Table 6 Content of index components and extraction rate in Decoction (%,n=2)

表7 物质基准中指标性成分的含量及干粉得率(%,n=2)Table 7 Content of index components and dry powder yield in substance standard (%,n=2)

表8 饮片到水煎液中指标性成分的转移率(%,n=2)Table 8 Transfer rate of index components from decoction pieces to Decoction (%,n=2)

表9 水煎液到物质基准中指标性成分的转移率及浸膏转移率(%,n=2)Table 9 Transfer rate of index components and extract from Decoction to substance standard (%,n=2)

由表5～9可知,15批易黄汤物质基准中尿囊素含量为0.801%～1.087%、饮片到水煎液的转移率为62.34%～88.17%、水煎液到物质基准的转移率为73.09%～91.37%;没食子酸的含量为0.047%～0.057%、饮片到水煎液的转移率为59.73%～84.16%、水煎液到物质基准的转移率为74.99%～89.32%;京尼平苷酸的含量为0.037%～0.081%、饮片到水煎液的转移率为11.54%～26.98%、水煎液到物质基准的转移率为71.77%～94.38%;小檗碱的含量为0.250%～0.387%、饮片到水煎液的转移率为10.46%～16.73%、水煎液到物质基准的转移率为76.54%～88.43%,均未出现离散数据(平均值的70%～130%以外)。15批易黄汤水煎液的出膏率为12.49%～16.37%,15批易黄汤冻干粉(物质基准)的干粉收得率为12.30%～14.66%,水煎液-冻干粉的浸膏转移率为82.71%～99.24%,均未出现离散数据(平均值的70%～130%以外)。以上结果显示,易黄汤中4种指标性成分在饮片-水煎液-冻干粉(物质基准)中的传递均较为稳定,根据相关规定,不同批次物质基准的指标性成分含量及转移率应控制在其均值的70%～130%,本实验中15批易黄汤物质基准的各指标性成分的含量及转移率均在范围内,说明实验前期物质基准的制备工艺可以实现各成分含量的稳定传递。

3 讨论

经典名方物质基准作为后续复方制剂生产及质量控制的参照,在研究过程中具有核心地位[7],指标性成分的选择在物质基准质量的控制中具有重要意义。易黄汤君药山药中主要含有尿囊素、薯蓣皂苷元、腺苷和多糖等化学成分[13],其中尿囊素、腺苷和薯蓣皂苷常作为山药药材的质控指标[14-15]；另一味君药芡实中没食子酸等酚酸类成分具有抗菌、抗炎等药理作用[16-17]。佐药车前子中主要含有环烯醚萜苷类、多糖类和黄酮类等成分[18],环烯醚萜苷类成分具有保肝、降血糖、抗炎、调节免疫等作用[19]；另一味佐药黄柏中主要含有小檗碱和黄柏碱等生物碱类,具有显著的抗炎和抗菌作用[20-21]。黄柏碱和小檗碱均为黄柏中的指标性成分,而易黄汤中黄柏碱相对小檗碱含量较低,可仅选择小檗碱作为含量测定中表征黄柏药材的指标性成分。故本实验选取君药山药中尿囊素、芡实中没食子酸，佐药车前子中京尼平苷酸、黄柏中小檗碱4种成分作为含量测定的指标性成分,建立含量测定方法和进行量值传递研究。

本研究采用HPLC法建立了易黄汤物质基准的特征图谱,确定了15个共有峰。对各个共有峰进行药味归属,其中炒山药、炒芡实、炒白果、酒车前子、盐黄柏5味药在特征图谱中均有体现,所建立的特征图谱实现了表征每个药味的要求。采用HPLC法测定了易黄汤中的4个指标性成分尿囊素、没食子酸、京尼平苷酸、小檗碱含量，测定方法稳定简便;以特征图谱和指标性成分的含量及转移率作为研究核心,对物质基准量值传递过程进行分析,为易黄汤质量评价和复方制剂的物质基准研发应用奠定基础,以期为中成药的创新开发及质量监管提供帮助。