生物气溶胶雾化器对大肠杆菌活性影响的评价

田 莹， 张国城， 李晶晶， 刘佳琪， 潘一廷，吴 丹， 沈上圯， 霍胜伟

(北京市计量检测科学研究院国家生态环境监测治理产品质量监督检验中心，北京 100029)

1 引 言

目前涌现出了一批荧光法生物气溶胶监测仪、生物气溶胶采样器等设备，而这些设备缺少相关的标准和评价方法[1～5]。为了对相关设备进行评价，需要模拟环境，产生具有特定种类、浓度和分布的生物气溶胶[6]。市场上存在的多种生物气溶胶雾化器，通过撞击、剪切流动、气泡爆裂等过程将大量流体分解成液滴，将生物分子由溶液雾化到环境中，形成相对稳定的生物气溶胶[7～10]。

气动雾化是最常用的雾化微生物的方法，其利用流速大、压强小的原理制成[11～13]。气动雾化可以产生高浓度的气溶胶，但同时由于强大的撞击力和剪切力会伤害和破碎微生物[14,15]。细胞悬液的频繁再循环，在长时间雾化过程中也会增加细菌的碎裂[16]。

市场上生物气溶胶生成设备众多，对于仪器的性能包括产生的生物气溶胶浓度，细菌可培养性和结构完整性等仍然缺乏相关的评价标准。因此，本研究的主要目标是系统地分析生物气溶胶发生器在产生的颗粒浓度和尺寸分布以及细菌细胞损伤方面的性能，根据可培养性和细胞膜完整性的损失来评估对细菌细胞的损害，从而选择合适的生物气溶胶雾化器。

2 实验方法

2.1 菌液的准备

本研究选用革兰氏阴性菌大肠杆菌作为测试菌种。大肠杆菌(ATCC 15597)在LB培养基中培养，实验之前，将大肠杆菌在50 mL的LB液体培养基中，37 ℃下培养过夜;然后，细菌用无菌去离子水洗涤2次，在7 000g相对离心力下离心5 min;之后，将大肠杆菌重悬于无菌去离子水中，qPCR结果细菌浓度为108CFU/mL。

2.2 测试系统

本研究主要测试了两种气压雾化器：ZR雾化器和FK雾化器，其中，ZR是传统的利用气动原理的雾化器，FK是常见的商品化的雾化瓶。图1展示的是实验的流程图和雾化器的原理图。所有的实验在生物安全柜中进行，每次实验前对所有的装置进行紫外灭菌30 min。在实验过程中，利用粒径谱仪(TOPAS LAP322)监测混合仓内大肠杆菌生物气溶胶的尺寸分布和浓度。TOPAS LAP322是基于光散射法的粒子测量仪器，可以提供0.2～40 μm气溶胶粒径测量范围。生物气溶胶采用BioSampler(SKC Inc.)收集，收集液为5 mL的无菌去离子水。采样流量为12.5 L/min，采集时间为 10 min。采集完之后剧烈涡旋300 s，混匀所收集的样品，然后向两个EP离心管(1.5 mL)中各加入1 mL液体进行样品分析。ZR的进气流量分别为5，7，9 L/min，FK雾化器的进气流量分别为1，2，3 L/min。

图1 实验流程图Fig.1 Experimental flow chart

2.3 细菌破损比例

大肠杆菌生物气溶胶的数量浓度基于直径大于0.523 μm的颗粒总数浓度[16]。对于产生的大肠杆菌生物气溶胶，破损的比例为：

式中：C1即为破损的细菌浓度，粒径范围在0.363～0.555 μm，小于 0.5 μm的细菌颗粒被认为来自受损细菌的碎片，而0.363 μm是粒径谱仪能检测到的细胞碎片的下限[17]；C2为总的数浓度。

2.4 细菌的可培养率

可培养的细菌个数通过平板法获得。取100 μL的采集液梯度稀释涂布在LB固体培养基上，37 ℃下培养16 h，形成肉眼可见的菌落，通过肉眼计数得到菌落个数，并根据采样体积计算测量舱中可培养菌的浓度Cculturable。样品总的细菌数Ctotal通过qPCR获得。因此，大肠杆菌悬液的可培养率为：

相对于新鲜的菌液，采集的微生物气溶胶样品的细菌可培养率比例的减少，用CR表示：

式中：η1是大肠杆菌经过雾化，BioSampler采集后大肠杆菌的可培养率；η2是新鲜的大肠杆菌菌液的可培养率。

2.5 细胞膜损伤指数

文献[16]中指出，细菌膜结构在雾化和采样过程中可能会受损，导致DNA作为游离分子释放到采集液中，同时引入细胞膜损伤指数来量化损伤。膜损伤指数I为膜损伤细菌细胞释放的16S rRNA基因与样本中16S rRNA基因总量的比率，变化从“0”(无损伤)到“1”(细菌的所有基因组DNA均被释放)。

式中：Ns指的是在采样液上清中的16S rRNA基因拷贝数的浓度；Np指的是采样液离心后沉淀样品中的16S rRNA的基因拷贝数浓度。

由于雾化的大肠杆菌使用相同的采样条件(BioSampler采集)，细胞膜损伤指数可以用来比较不同气溶胶发生器在雾化过程中对细菌施加的压力。将BioSampler采集的液体取1 mL转移到干净的1.5 mL离心管中，在16 000g相对离心力下离心10 min。然后将950 μL上清液转移到新的无菌1.5 mL离心管中，同时对剩余的含有细胞沉淀的50 μL液体进行DNA提取。在离心后的样品中，上清液中的DNA来自失去膜完整性的细胞，而沉淀中的DNA来自保持膜完整性的细胞。

2.6 DNA提取和定量PCR

探针法实时荧光定量PCR，可以对总的生物气溶胶浓度进行定量检测，灵敏度和特异性极高[18]。将上清和沉淀的样品通过细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302，天根生化科技有限公司)提取基因组DNA，最终溶解到50 μL的超纯水中。

正向引物:

5′-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′

反向引物:

5′-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3′

探针:

(6-FAM)-5-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′-(TAMRA)

反应体系为50 μL。包括:5 μL DNA模版；1 μL 10 mmol/L的引物；1 μL 10 mmol/L的探针；25 μL的2×Taq PCR预混合液(KT201，天根生化科技有限公司)；17 μL的超纯水。整个qPCR实验在罗氏LightCycler 480仪器上进行。循环参数为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，40个循环(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)。所有的引物和探针都是由上海生工生物工程有限公司合成。超纯水作为qPCR实验中的阴性对照。

2.7 数据的分析

本研究使用Prism 8.0软件进行作图和数据分析。使用单因素方差分析不同进气流量对破损比例，细胞膜损伤指标，可培养率比例的减少量的影响。p值小于0.05表示统计学上有显著性差异。

3 实验结果

3.1 大肠杆菌气溶胶雾化后的粒径分布

为了探索不同进气流量对雾化器产生的生物气溶胶粒径的影响，我们利用粒径谱仪对大肠杆菌气溶胶粒径进行了监测。如图2所示，ZR雾化器产生的生物气溶胶峰值对应的粒径大小为0.932 μm，而FK雾化器产生的大肠杆菌气溶胶粒径直径为1.071 μm，很可能是因为FK雾化器在雾化的过程中湿度更高，导致产生的颗粒物粒径更大[6]。本研究选择的进气流量是这两种雾化器的常用流量，可以观察到FK雾化器产生的颗粒物个数相对于ZR的雾化器数浓度更高，而且整体雾化的气溶胶浓度会随着流量的增大而增高，但对生物气溶胶峰值所对应的粒径大小没有明显的影响。

图2 不同雾化器产生的大肠杆菌气溶胶的粒径大小分布Fig.2 Particle size distribution of E.coli aerosol produced by different atomizers

单独雾化超纯水时，粒径谱仪在0.203～0.266 μm的读数有明显的增加。而粒径大小范围在0.363～0.555 μm的碎片很可能是在雾化过程中细胞经历了强烈的机械应力，导致细胞破碎，因此用来评价不同雾化器的性能[19]。如图3所示(图中ZR-n，FK-n中的n代表进气流量为n,单位L/min)当ZR雾化器的流量从5 L/min增加到7 L/min，9 L/min时，相应的细菌破损比例F为(15.67±0.58)%，(15.33±2.08)%，(19.33±0.58)%，其中流量为5 L/min和7 L/min之间没有明显差异，而当进气流量为9 L/min时，破损比例F显著高于另外两组。可能是因为雾化引起的机械应力越强，细菌在气雾化过程中破碎成碎片的机会就越大，加上容器内的液体再循环，雾化器中的细菌会受到反复的剪切力和撞击力。这与图2的结果相一致，雾化产生的颗粒物个数在9 L/min时更为明显。同样地，FK雾化器的进气流量为1 L/min和2 L/min时，破损比例F基本相当，而流量为3 L/min时，F增加到(23.00±2.83)%。

图3 雾化器在不同进气流量下的破损比例Fig.3 The damage ratio of the atomizer under different intake air flow

3.2 细胞膜损伤指数

采用间接方法通过计算每个样品的I值来评估细胞膜损伤的程度[14]。BioSampler采集液中检测到的游离DNA可能是由于气溶胶化和采样压力共同造成的[14]。由于BioSampler在所有实验中的工作条件相同，因此它对细胞膜损伤指标的贡献是一定的，最终I值的差异很可能是由于雾化过程造成的。生物气溶胶发生器对大肠杆菌菌液施加压力，导致细胞膜破裂，基因组DNA作为游离DNA分子释放到采集液中。如图4所示，当进气流量增加时，ZR雾化器的I值明显增加，表明雾化对细胞膜完整性产生了显著影响，这与细菌破损比例的结果相一致，表明细菌在雾化过程中，当进气流量增加到一定程度，压力变得足够大时，细胞膜发生破损，导致基因组DNA在内的细胞质成分被释放并雾化为游离颗粒；而FK雾化器在进气流量增加到3 L/min时，I值没有显著的变化，可能是雾化瓶本身结构设计导致的差异。

图4 雾化器在不同进气流量下的细胞膜损伤指数Fig.4 The cell damage index of the nebulizer under different intake air flow

3.3 可培养率的变化

空气传播的微生物根据其生理状态可以分为可培养、可存活但不可培养、不可存活但保持膜完整性和细胞碎片。因此，可培养性的变化也是评价雾化器性能的重要指标之一。如图5所示，当进气流量为5 L/min时，ZR雾化器发生的气溶胶可培养率比值的减少量CR达到90%以上，并且随着流量增加到97.78%。同样地，FK雾化器的CR值从低流量的94.00%增加到高流量的99.24%。进一步证明了经过雾化和采样的过程，细菌的存活状态发生了明显变化，可培养性严重降低[10, 20]。很大程度上是因为在雾化和撞击器壁期间，具有细胞膜的微生物反复暴露于剪切力，可能被损坏或失去活力，并且降解过程依赖于所施加的压强。研究发现，革兰氏阴性菌大肠杆菌相对于革兰氏阳性细菌对机械应力更为敏感，因此在雾化过程中细胞结构更易受损[21]。

图5 雾化器在不同进气流量下的可培养率的变化Fig.5 The change of the cultivable rate of the atomizer under different intake air flow

4 结 论

实验室生物气溶胶旨在受控的环境条件下模拟大气生物气溶胶的特性，有助于更好地了解微生物在空气中的传播。在实验室中产生生物气溶胶具有一定的局限性，通常无法复制生物多样性； 但对于生物采样器效率、暴露风险评估以及针对生物气溶胶防护技术的有效性都有着重要意义。

本研究探讨了不同气溶胶发生器在产生的颗粒数量浓度和尺寸分布、细菌可培养性损失和细胞破碎方面的差异，这在很大程度上取决于每个设备的结构。大粒径颗粒的产生很可能是由于高湿度导致的，吸湿性生长或者多个细菌颗粒团聚导致细胞大小不同。小粒径颗粒则是因为雾化过程对微生物的机械应力导致细菌细胞破碎从而产生，并且细菌碎片比例F值和细胞膜破损指数I值随着进气流量的增加而增加。

本课题对生物气溶胶发生器的选择提供参考依据，不仅需要考量生物气溶胶的物理特性(例如粒子数浓度、尺寸分布)，更要关注其生物参数(例如可培养性和结构完整性)。一些雾化器内的悬浮菌液随着不断的循环而受到反复的剪切和撞击应力，气溶胶发生时间越长，细菌的损伤越严重，因此需要避免长时间的雾化。不同的生物气溶胶类型由于大小形状各异，在雾化效率、结构完整性和雾化过程中的存活能力方面可能表现不同。因此，在未来的研究中，有必要对雾化不同生物气溶胶类型时各种雾化器的性能进行研究。