L-瓜氨酸对缺血再灌注损伤心肌的保护作用及机制研究

李志乐 韦秋宇 言纬 刘燕 韦宝敏 黄照河

急性心肌梗死（AMI）是冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）最常见的急危重症[1-2]。再灌注治疗是挽救AMI 患者的有效治疗手段。但心肌缺血再灌注损伤（MIRI）严重影响患者的临床预后。如何有效防治MIRI 是心血管领域研究的热点问题。研究表明，AMI 患者体内精氨酸严重不足，可导致机体功能及能量代谢紊乱，但是直接补充外源性精氨酸并不能使患者临床获益，甚至可能导致死亡率增加，其原因可能与精氨酸/瓜氨酸-一氧化氮循环中产生的一氧化氮（NO）效应分子有关[3-5]。基于瓜氨酸可负反馈调节NO 生成并内源性合成精氨酸的特点，本研究通过构建MIRI 兔模型，探讨L-瓜氨酸对MIRI 兔心肌的保护机制，为临床MIRI 防治提供新的方向和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

L-瓜氨酸购自北京索莱宝科技有限责任公司，用超纯水对L-瓜氨酸溶解稀释，浓度为100 μg/L，置于4 ℃冰箱供实验使用。心肌酶谱类测定系列试剂盒购自德国ProDia GmbH 公司，2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色液购自上海博湖生物科技有限公司，原位末端转移酶标记技术（TUNEL）试剂购自英国Abcam 公司。7170 型全自动生化分析仪购自深圳市库贝尔生物科技公司，ECG-2350 心电图机购自日本光电公司，DMR＋550 型病理图像分析仪购自德国Leica 公司，SAR-830 小型动物呼吸机购自北京世联博研科技有限公司。

1.2 分组及处理方法

选取成年健康新西兰大白兔30 只，清洁级，雄性，3 个月龄，体质量2.0～2.5 kg，购自右江民族医学院实验动物中心。本实验获得右江民族医学院动物实验伦理委员会批准。采用随机数字表法分为对照组、模型组与实验组，各10 只。手术前禁食12 h，大白兔称量体质量后，予20%氨基甲酸乙酯耳缘静脉注射麻醉，麻醉后仰位固定于手术操作台上，ECG-2350 心电图机连接于四肢，行气管内插管并连接SAR-830 小型动物呼吸机，调整呼吸机参数。常规备皮消毒，沿胸骨正中线依次切开皮肤、胸骨，撑开胸廓并固定，充分暴露心脏。参照文献[6]，采用结扎左冠状动脉前降支30 min，再灌注2 h 的方法构建在体兔MIRI 模型，实验组在构建兔MIRI 模型前1 h 予经股静脉注射L-瓜氨酸100 μg/L 预处理；模型组给予经股静脉注射等量的生理盐水。对照组只开胸不结扎。评估MIRI 模型成功的心电图标准[7]：结扎左冠状动脉前降支30 min 后，T 波高尖或ST 段明显抬高；再灌注2 h后，T 波回落或已抬高的ST 段下降50%以上。

1.3 血清心肌酶检测

再灌注实验结束后，分别采集兔腹主动脉血2 mL，静置30 min 后3 000 转/min 离心15 min，分离血清备测。采用7170 型全自动生化分析仪检测血清心肌酶包括肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）的水平。

1.4 心肌组织苏木精-伊红染色

再灌注实验结束后，分离取出兔心脏，用生理盐水冲洗并分离左心室前壁心肌组织，置于10%缓冲甲醛液中固定24 h，石蜡包埋，心肌组织连续切片，厚度约为5 μm，常规进行苏木精-伊红（HE）染色。

1.5 TTC染色检测心肌梗死面积

再灌注实验结束后，在分离的左心室前壁心肌组织中，选取左心室相同区域缺血与再灌注部位心肌组织制成2 mm 切片。在暗室避光操作，将切片置于2%TTC 染色液中，用锡箔纸盖住后，置于37 ℃温箱30 min，翻动切片，使之充分接触染色液。切片晾干拍照，采用病理图像分析仪评估心肌梗死面积。

1.6 TUNEL法检测心肌细胞凋亡

再灌注实验结束后，将获取的心肌组织于10%缓冲甲醛液中固定，石蜡包埋，制成5 μm 切片，将切片置于染色缸中，予二甲苯脱蜡，不同浓度无水乙醇水化，PBS 漂洗2 次后加入蛋白酶K 溶液（20 μg/mL），置于室温水解30 min。用含2%过氧化氢的PBS 漂洗2 次，置于室温反应5 min。按TUNEL 试剂盒说明书方法，在暗室避光操作，首先进行生物素标记，然后予DAB 显色、蒸馏水冲洗、甲基绿复染、正丁醇冲洗、二甲苯脱水及中性树胶封片。切片干燥后，每个切片选取10 个不同区域在光学显微镜（×400）下进行观察计数，细胞染色呈棕色的为TUNEL 阳性细胞。

1.7 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较和组内比较分别采用配对t检验和单样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在体兔MIRI模型的评估

模型组兔左冠状动脉前降支结扎30 min 后，心电图显示ST 段明显抬高，伴有T 波增高，表现为ST-T 改变；再灌注2 h 后，ST 段和T 波较缺血时明显下降或回落，但较缺血前仍有明显增高（P＜0.05），表明在体兔MIRI 模型构建成功。见图1 和表1。

图1 模型组兔心肌缺血再灌注前后心电图的演变

表1 模型组兔心肌缺血再灌注前后心电图的变化

2.2 L-瓜氨酸对MIRI兔心肌酶指标的影响

与对照组相比，模型组和实验组兔血清中CK、CK-MB 及LDH 的水平均明显升高（P均＜0.05）。与模型组相比，实验组兔血清中CK、CK-MB 及LDH 的水平均显著下降（P均＜0.05），提示L-瓜氨酸可明显减轻兔MIRI 导致的急性心肌损伤。见表2。

表2 3组兔血清中CK、CK-MB及LDH水平比较

2.3 L-瓜氨酸对MIRI兔心肌组织病理改变的影响

HE 染色结果显示，对照组兔心肌组织结构层次完整清晰，细胞排列整齐有序，细胞核清晰可见，染色浓淡均匀一致。模型组兔心肌组织结构层次欠完整清晰，纤维细胞和肌节结构紊乱，可见纤维断裂现象，细胞核固缩，染色颜色变深，细胞间红细胞渗出，可见较多空泡。与模型组相比，实验组兔心肌组织结构层次较为规则，可见心肌纤维水肿减轻，细胞核染色均匀，胞浆浓染减轻，细胞间红细胞渗出减少，提示L-瓜氨酸可改善MIRI 导致的兔心肌组织病理形态学变化。见图2。

图2 3组兔心肌组织病理形态学结果（HE染色，×400）

2.4 L-瓜氨酸对MIRI兔心肌梗死面积的影响

采用TTC 染色检测心肌梗死面积，结果显示对照组兔心肌未见梗死灶，模型组心肌梗死面积[（78.02±5.66）%]明显高于对照组[（5.01±0.32）%]，实验组心肌梗死面积[（36.24±3.78）%]显著低于模型组（P均＜0.05），提示L-瓜氨酸能够明显减少MIRI 所致的兔心肌梗死面积。见图3。

图3 3组兔心脏大体和切片TTC染色结果

2.5 L-瓜氨酸对MIRI兔心肌细胞凋亡的影响

采用TUNEL 法检测心肌细胞凋亡的情况，褐黑区为凋亡细胞。结果显示对照组兔心肌细胞凋亡率为（4.05±0.32）%，模型组兔心肌细胞凋亡率[（46.26±6.58）%]明显高于对照组，实验组兔心肌细胞凋亡率[（28.42±3.52）%]显著低于模型组（P均＜0.05），提示L-瓜氨酸能够减轻MIRI 导致的兔心肌细胞凋亡。见图4。

图4 3组兔心肌细胞TUNEL染色结果（×400）

3 讨论

AMI 是严重危害人类健康的心血管疾病，即使早期静脉溶栓成功或通过介入术开通梗死相关血管，临床上仍约有30%的患者发生MIRI[8-9]，加重不可逆的心肌细胞死亡，导致左室重构，影响AMI患者的远期预后。目前MIRI 的形成机制尚不明确，与氧化应激、炎性反应、内质网应激、细胞内钙超载、细胞凋亡等因素密切相关，导致心肌细胞坏死或程序性死亡[10]，诱发再灌注心律失常、心肌顿抑、微血管栓塞及致死性心肌再灌注损伤等心血管不良事件，前两者是可逆的，而后两者不可逆[11]，研究成功构建在体兔MIRI 模型，通过心肌组织病理分析发现，模型组兔心肌组织结构层次欠完整清晰，纤维细胞和肌节结构紊乱，纤维断裂，细胞核固缩，细胞间红细胞渗出，出现较多的空泡。CK、CK-MB、LDH 是临床上最常用的心肌坏死标志物，可作为反映MIRI 程度的检测指标。本研究结果显示，模型组兔血清中CK、CK-MB、LDH 水平，心肌梗死面积，心肌细胞凋亡率均明显高于对照组，提示MIRI 可加重心肌损伤，扩大梗死面积，增加心肌凋亡，影响AMI 的临床预后。临床上针对MIRI的防治原则是有效缩短心肌缺血再灌注时间窗，降低心肌组织氧耗，药物干预保护缺血心肌再灌注，缓解或防止再灌注损伤的发生[12-13]。然而，药物防治MIRI 仍然未能达到理想效果，需进一步探索开发新药物。

近期研究发现AMI 患者体内精氨酸严重不足，但直接补充外源性精氨酸不能使患者临床获益[3-5]。瓜氨酸作为L-α-氨基酸，具有扩血管、降血压等作用[14]，在心血管疾病治疗领域有广泛的应用前景。瓜氨酸可通过瓜氨酸-NO 循环，参与细胞内精氨酸合成NO 并发挥负性调节作用。机体内NO 生成过多可介导氧化应激，导致MIRI 时心肌损伤或凋亡，而瓜氨酸对NO 有负反馈调节作用，并参与内源性精氨酸合成，可以有效补充AMI 患者体内精氨酸，减轻MIRI 导致的心肌损伤或凋亡[5]。本研究结果显示，实验组兔血清中CK、CK-MB 及LDH 水平明显低于模型组，提示L-瓜氨酸可减轻MIRI 导致的急性心肌损伤。通过心肌组织病理分析也发现，L-瓜氨酸对MIRI 兔心肌细胞具有保护作用，其具体机制尚未明确，可能与以下几方面有关：（1）抑制炎性反应。MIRI 可诱发炎性反应，而白细胞介素（IL）-1β、IL-18 等炎性因子的活化和表达，可引起心肌损伤或凋亡[15]，导致MIRI 加重。L-瓜氨酸可明显抑制机体内促炎性细胞因子的产生，并维持巨噬细胞的迁移[16-17]，从而抑制炎性反应，减轻心肌凋亡，发挥对MIRI 兔心肌细胞的保护作用。（2）减轻氧化应激。MIRI 时心肌组织或细胞内可产生大量的活性氧（ROS），可影响线粒体功能，引起基因破坏甚至蛋白功能丧失，介导心肌细胞损伤的病理过程[18]，L-瓜氨酸可减少ROS 的产生[19]，减轻MIRI，从而保护心肌细胞。生理条件下NO作为体内重要的心血管内皮舒张因子，可以有效防止体内抗氧化剂的减少，减轻氧化应激损伤。因此，L-瓜氨酸可能通过改善L-精氨酸/NO 途径，负性调控NO 生成而减轻氧化应激，从而改善MIRI[20]。

综上所述，本研究提示补充L-瓜氨酸对兔MIRI 的保护作用与其抑制心肌细胞凋亡有关，这可为瓜氨酸在MIRI 防治中的临床应用提供理论依据，L-瓜氨酸有望成为MIRI 药物防治的潜在靶点。