优化样品留取方法可提高囊胚培养液中游离DNA整倍性的检测效率

黄锦 加加林 党玉姣 乔杰 刘平

非整倍体胚胎是导致体外受精-胚胎移植(invitro fertilization-embryotransfer,IVF-ET)妊娠率降低、流产率增高的一个重要因素。临床上，可以利用胚胎植入前遗传学整倍体检测技术(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)选择整倍体的胚胎移植，提高IVF-ET的妊娠结局[1-2]。但是，PGT技术需要胚胎活检，对胚胎是有创操作[3]；而且，由于胚胎存在嵌合的现象，活检的细胞只能在一定程度上代表胚胎的结果[4]。因此，寻求一种无创的、更全面反映胚胎的方法进行胚胎整倍体检测已成为该领域的热点研究内容之一。

胚胎培养液中存在游离DNA(cell free DNA，cf DNA),近年来，越来越引起生殖领域的关注。已经有学者利用囊胚培养液中cfDNA检测囊胚的整倍性[5-6]。由于胚胎培养液中游离DNA来源复杂且含量极少，给检测的准确性带来困难，限制了在临床上的应用。如何采集培养液标本，采集何种时段的培养液标本对于胚胎的诊断至关重要。因此，本研究针对培养液的不同采集方法与整倍性检测进行研究。

对象与方法

一、研究对象

本研究共纳入239枚囊胚，所有的胚胎均来源于北京大学第三医院生殖中心的PGT-A周期。纳入患者的PGT-A指征为女方高龄(>38岁)、复发性流产、反复着床失败。本研究获得北京大学第三医院医学伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

二、方法

1.促排卵和受精方式：按照本中心常规用药及监测方案进行控制性超排卵，注射hCG后36 h经阴道B超引导下卵泡穿刺取卵。所有周期都采用单精子卵母细胞内注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)方式受精。受精后16～18 h观察受精情况，第三天选择4细胞以上、碎片<50%的胚胎(多原核来源胚胎除外)进行囊胚培养。

2.PGT-A胚胎活检与遗传诊断：胚胎培养至第5～6天，选择4期以上、滋养层细胞或者内细胞团其中一项评级为B以上的囊胚(Gardner评分标准[7])进行活检，激光活检3～5个滋养层细胞。活检的滋养层细胞采用SNP芯片检测胚胎的整倍性进行遗传检测，SNP array 芯片采用ILLUMINA公司的Human CytoSNP 12V-2.1芯片，活检后的细胞采用多重置换扩增(multiple dilacement amplification, MDA)方法全基因组扩增后，杂交至芯片，扫描后的数据采用Illumina Genome Studio软件分析。活检后的囊胚进行玻璃化冷冻。

3.培养液收集与检测：胚胎在D3天更换囊胚培养液，并采取单胚胎单独培养，收集可以PGT-A活检囊胚的培养液。收集方法分为三个阶段，即(1)第一阶段。胚胎D3天打孔后转入囊胚培养液，收集D3～D5/D6的培养液；(2)第二阶段。胚胎D3天打孔后转入囊胚培养液，D4天再转入另一新的培养液，收集D4-D5/D6的培养液；(3)第三阶段。胚胎不做打孔处理，D3天再次用合适内径的剥卵针轻柔地去除颗粒细胞后转入囊胚培养液，D4再转入另一新的培养液，收集D4～D5/D6的培养液。

囊胚活检后，留取相应的培养液滴至PCR管中，-20℃保存。囊胚在活检前不进行皱缩，所有收集的囊胚培养液样本不含有囊胚皱缩后产生的囊腔液。所有样本均进行无创胚胎染色体整倍性筛查(noninvasive preimplantation genetic testing for aneuploidy,NiPGT-A)检测整倍性,即先将样本进行多次退火环状循环扩增(multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC)扩增后，采用二代测序(next generation sequencing,NGS)方法检测整倍性[8]。

4.胚胎移植：PGT-A结果为整倍性的胚胎可以移植。所有周期均采用解冻单囊胚移植。本研究中共有56枚PGT-A整倍性胚胎移植，分析对应胚胎的NiPGT-A结果，统计临床妊娠结局。

5.统计学处理:背靠背获得囊胚的PGT-A结果和培养液的NiPGT-A结果。分析NiPGT-A方法的检出率、NiPGT-A结果与PGT-A结果倍性一致性、整倍体符合率、非整倍体符合率、颗粒细胞污染率等。

结 果

239枚囊胚中209枚囊胚有NiPGT-A结果，NiPGT-A检出率为87.5%(209/239)。随着采样方法的改进，NiPGT-A结果与PGT-A结果倍性一致性、整倍体符合率逐渐提高，颗粒细胞污染率逐渐降低。见表1。

表1 不同采样阶段培养液中游离DNA整倍性与囊胚滋养层细胞整倍性的结果比对Table 1 Comparison of NiPGT-A and PGT-A results at different sampling phases

239枚胚胎中有56枚PGT-A整倍体的胚胎移植，其中23枚胚胎的结局为活产/持续妊娠。NiPGT-A没有结果的胚胎妊娠率较高(71.4%，5/7)，高于NiPGT-A为整倍体或者非整倍体胚胎的临床妊娠结局(整倍体：33.3%，9/27；非整倍体：40.9%，9/22)。见表2。

表2 移植胚胎的NiPGT-A结果与妊娠结局的关系Table 2 Relationship between NIPGT-A results of embryo transfer and pregnancy outcome

讨 论

2013年，分别有学者在囊胚腔液和胚胎培养液中发现有游离的DNA，可用于预测胚胎遗传学或形态学特征[5-6]。由于囊胚腔液极少而且获取不易，不论是显微操作法或者囊胚皱缩法均对胚胎是有创操作。因此，国内外许多学者将研究焦点集中在囊胚培养液中cf DNA。

囊胚培养液的体积很小，大约10～50微升左右，其中的cf DNA含量甚至少于单细胞DNA的含量，这些都给该领域的研究带来困难。目前，囊胚培养液cf DNA与对应囊胚的整倍体关系研究颇多[8-10]。2016年，有学者报道已经利用该技术分娩健康婴儿[8]。然而，更多的研究显示，培养液中cf DNA的整倍性与胚胎的一致性并不稳定。Vera-Rodriguez等研究发现[11]，培养液中cf DNA的整倍性与PGT周期的滋养层细胞活检的符合率仅有67%。Capalbo 等的研究提示[12]，在PGT-M周期，囊腔液cf DNA与滋养层细胞活检的符合率仅2.9%(2/69),培养液cf DNA与滋养层细胞活检的符合率20.8%(15/72)；在PGT-A周期中，cf DNA的扩增失败率较高65.2%，扩增成功的样本与PGT-A符合率为37.5%。因此，在目前的技术条件下，培养液cf DNA的检测结果应用于临床还需要进一步完善。

囊胚培养液中cf DNA来源与组成成份十分复杂，这也是目前cf DNA检测结果不能广泛应用于临床的主要原因之一。培养液cf DNA可能来源于囊胚滋养层细胞，可能来源于囊胚内细胞团细胞，也可能来源于卵裂球细胞，甚至还可能来源于包绕卵母细胞的颗粒细胞。如果cf DNA中来自于颗粒细胞的比例过大，就会导致cf DNA检测结果不能反映胚胎的真实状况，发生母源污染引起误诊。许多学者的研究已经注意到母源污染的存在以及对诊断结果准确性的影响[11-12]。因此，囊胚培养液的采集方法对cf DNA检测结果至关重要。对于该技术的准确性与否，通常与临床上广为应用的PGT-A检测结果做参考进行比较。临床上PGT囊胚活检主要有两大类不同方法，包括D3打孔、囊胚形成疝再行活检以及D3不打孔、囊胚期活检前或者活检同时再进行打孔。因此，本研究针对PGT周期，分别采用了三种不同的囊胚培养液的采集方法，背靠背比较了cf DNA与相应囊胚滋养层细胞的结果。在第一阶段，胚胎D3天打孔，由于胚胎中含有碎片，打孔后会有碎片释放到培养液中；因此，虽然第一阶段的cf DNA检出率较高(94.0%)，但是倍性符合率仅为55.0%。第二阶段中，为了减少漏出的胚胎碎片对cf DNA检测准确性的影响，胚胎D3天打孔，D4天再转入另一新的培养液，收集D4～D5/D6的培养液；倍体符合率高于第一阶段(69.2% vs 55.0%)，特别是非整倍体符合率为100%。第三阶段中，胚胎不做打孔处理，D3再次去除颗粒细胞,D4转入另一新的培养液，收集D4～D5/D6的培养液。cf DNA检出率为86.0%，倍性符合率为76.7%。随着采样方法的逐步优化，倍性符合率逐渐增加，污染率也逐渐下降(9.3%、7.7%、2.3%)。本研究发现，在卵裂期再次去除颗粒细胞、收集D4到D5/D6的囊胚培养液，是一种较理想的NiPGT-A检测的采样方法。

众所周知，囊胚的内细胞团细胞是未来发育成胎儿的部分，而滋养层细胞是胎盘和胎膜的起源。目前，临床PGT周期采用的是滋养层细胞活检，由于胚胎存在嵌合现象，有时候PGT结果并不能反映胚胎真实的整体状况。那么，培养液中cf DNA是包含内细胞团、滋养层等细胞释放的DNA混合体，会不会更好地反映胚胎的真实情况？Huang等[13]针对PGT周期捐赠的胚胎进行研究，研究人员将胚胎解冻后单独培养，检测培养液cf DNA、整个胚胎的整倍性，并且与之前的PGT滋养层细胞检测结果作比较。Huang等[13]研究结果提示，cf DNA检测能更好地代表胚胎整体状况，检测的特异性(80.0% vs 50.0%)和整倍体符合率(83.3% vs 62.0%)均优于PGT的滋养层细胞检测。但是，也有学者提出[14]，囊胚期的胚胎具有自我修复能力，而且培养液中的cf DNA主要是来自内细胞团还是滋养层细胞尚不清楚。因此，cf DNA检测是否能更好地反映胚胎状况还需要进一步研究。

本研究发现了一个有趣的结果，移植的胚胎中，7枚NiPGT-A扩增失败没有结果的胚胎，5枚获得临床妊娠(71.4%)。这可能是由于胚胎质量好，凋亡的细胞少，培养液中cf DNA含量少的缘故所致。这也提示在临床应用中，NiPGT-A无检测结果的胚胎还应该慎重评价。

对于NiPGT-A是否能够应用于临床，引起了生殖领域的广泛关注。目前，已经有一些学者开展了临床研究。Rubio等[15]在4大洲的8个生殖中心开展了一项分析NiPGT-A与PGT-A结果一致性的研究，研究的中期(1/3结点)分析结果显示，结果一致性为78.2%(62.1%～85.7%)，且不同的取卵方案、培养条件、胚胎质量不影响NiPGT-A结果的准确性。

囊胚培养液中的cf DNA虽然含量少，成份来源复杂，但是能够提供胚胎的内在信息，并且对胚胎是一种无创方法。因此，众多学者正在探索其在临床应用的可行性及有效性。本研究通过优化采样方法，提高cf DNA的检测效率和准确性，推荐D3天再次去除颗粒细胞，采集D4～D5/6天囊胚培养液，而且不针对胚胎进行打孔处理。本研究提出了采样方法对Ni-PGT检测结果准确性的重要意义，为将来该技术在临床应用提供可行性参考。