非洲猪瘟CD2v截短蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

胡巧云,黄小久，唐小明，何世成，林 源，彭 志，石 建，王卫国，刘道新，王昌建* (.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南 长沙 4004；．湖南中净生物科技有限公司，湖南 长沙 40600)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]，以毒力强、病程短、传染迅速、发病率及致死率高为特征。自1921 年肯尼亚首次发现ASF以来，该病毒一直在非洲大陆流行，2007—2017年逐渐扩散到欧洲国家[2]。2018年该病毒传入我国，在国内迅速传播开来，给我国养猪业造成非常惨重的经济损失[3]。目前，ASF已成为国内猪病危害最为严重的疫病。

ASFV是一种虫媒DNA病毒，是黄病毒科的唯一成员，基因组为170～193 kb，有151～167个读码框(open reading frames，ORFs)，编码约54种结构蛋白和超过100种非结构蛋白。目前ASFV有24个基因型和8个血清型，我国的流行毒株属于基因Ⅱ型和血清8型[4]。由于ASF的防控尚没有有效的药物及安全的疫苗，一直以生物安全防控为主，采取检测加清除策略。目前OIE推荐的病原检测方法包括PCR和荧光定量PCR，推荐的抗体检测是ELISA方法进行抗体初筛，辅助以其他方法证实如免疫印迹试验(IBT)、间接免疫荧光抗体试验(IFA)和间接免疫酶试验(IPT)，目前国内基本上以荧光定量PCR核酸检测方法为主[5-6]。随着ASF在猪群循环2年多来，疫情发展趋势变缓，出现感染潜伏期长，病程长，死亡率降低的现象，且感染早期不易检测到[7]。当猪群被弱毒株感染时，由于携带病毒时间长、排毒量低，依赖荧光定量PCR方法极有可能检测不出，临床ASF病原检测需结合评估群体抗体水平来判断群体感染情况[5]。

CD2v蛋白是ASFV的外膜蛋白，由EP402R基因编码。由于该蛋白类似于T淋巴细胞表面受体CD2而得名，由信号肽序列和1个跨膜区组成，含有2个免疫球蛋白样的结构域。在感染过程中，CD2v蛋白与猪红细胞表面的CD2受体发生特异性结合，介导ASFV粒子吸附在猪的红细胞表面[8]，在病毒黏附和免疫逃避中起作用。ASFV Georgia株缺失CD2v基因后，感染猪对发病和毒血症无明显影响[9]。而我国近期分子流行病学报道显示，临床上出现了由于CD2v自然变异失去红细胞吸附能力，攻毒试验发现这些病毒均为弱毒，潜伏期长，致猪群的死亡率下降[10-11]。鉴于目前临床流行毒株复杂情况，为更好的了解ASF的流行趋势，适应当下的防控形势，建立快速、特异性强和灵敏度高的ASFV诊断方法对于有效控制疫情，准确鉴别、鉴定尤显重要。

本研究用原核表达ASFV CD2v蛋白胞外区段作为包被抗原，建立了间接ELISA检测方法，并评估了其特异性、敏感性和重复性，且与目前商品化的试剂盒做了比较，为ASF的检测和防控提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料ASF阴性血清由本实验室保存，为我国ASF发生以前的健康猪血清；猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)和猪圆环病毒(PCV)等阳性血清由本实验室保存；用于CD2v抗体检测及敏感性试验的ASFV阳性感染血清由哈尔滨兽医研究所提供；大肠杆菌BL21(DE3)PLys感受态细胞、DL2000 DNA Marker、彩虹180光谱蛋白Marker购自Solarbio公司；羊抗猪的HRP-IgG购自美国Jackson Immuno Research公司；PVDF膜购自Millipore 公司产品；ELISA所用底物、脱脂奶粉购自生工生物工程(上海)公司；超级ECL发光试剂盒购自Thermo Scientific公司。2个国产试剂盒(国产1、国产2)来自大型诊断试剂公司，2个进口试剂盒(进口1、进口2)分别购自俄罗斯LJ公司和法国IDV公司。

1.2 CD2v蛋白的序列分析、预测及载体构建以ASFV的HLJ18株基因组序列(MK333180)为参考，该病毒株CD2v蛋白有360个氨基酸，根据TMHMM软件分析该蛋白的跨膜区段，以及Singal P 5.0分析该基因的信号肽疏水区域，预测结果为氨基酸1～206位为蛋白膜外结构，氨基酸207～229位为蛋白的跨膜结构，氨基酸230～360位为蛋白的膜内结构，其中1～15位氨基酸为信号肽区域。因而选择蛋白的胞外结构即16～206的氨基酸序列表达截短的CD2v蛋白。序列经大肠杆菌表达系统密码子优化后，两端加入酶切位点BamHⅠ/XhoⅠ，连接至pET28a载体上，构建表达载体命名为pET28a-CD2v。序列由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 重组蛋白的表达、纯化与Western blot鉴定将测序正确的重组载体pET28a-CD2v质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，构建菌株pET28a-CD2v/BL21(DE3)pLysS，用于蛋白的表达与纯化。将含有重组质粒的表达菌株过夜培养液，以1∶100接种于新鲜的LB培养基中，37℃摇床振荡培养，至D600 nm值为0.6～0.8时，加入0.8 mol/L的IPTG诱导，37℃ 继续摇床培养3 h。收集诱导的菌体进行SDS-PAGE鉴定其表达的情况。使用超声波破碎的菌体，使用蛋白纯化试剂盒(生工生物工程(上海)公司)按照说明书进行纯化，用5 mmol/L的咪唑平衡层析柱，40 mmo/L的咪唑洗涤杂蛋白，用250 mmol/L 咪唑洗脱目的蛋白，纯化后的蛋白用3M超滤离心管浓缩，用0.1 mol/L的PBS为缓冲液。

诱导后的pET28a/BL21(DE3)pLysS以及纯化后的蛋白制作样品后，进行SDS-PAGE电泳。将电泳产物使用电转仪转移至PVDF膜上，与1∶200稀释的ASF阳性血清室温反应1 h后，洗涤并加1∶50 000 稀释的羊抗猪HRP-IgG室温反应1 h，再与ECL发光液反应后在化学发光成像仪上观察特异性条带并拍照。

1.4 抗原和血清最佳稀释度的确定在96孔ELISA板上，将抗原按照2倍倍比稀释自上至下包被，阴、阳性血清自左至右2倍倍比稀释，抗原的包被质量浓度依次为100.000，50.000，25.000，12.500，6.250，3.125，1.563 μg/L；阴、阳性血清稀释度为依次1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800。根据阳性血清D450 nm值(P)和阴性血清D450 nm值(N)的比值即P/N值筛选最佳抗原包被质量浓度和血清稀释度。确定抗原包被质量浓度和血清稀释度后，对羊抗猪HRP-IgG稀释度1∶50 000，1∶100 000，1∶200 000，底物显色时间5，10，15，20 min等条件进行优化，最终确定间接ELISA的反应条件。

1.6 特异性、敏感性和重复性试验选取PRRSV、CSFV、PRV(gI)、PRV(gb)、FMDV阳性血清各5份，并设置ASFV阴、阳性血清对照，用本试验优化的间接ELISA方法进行检测，以评价所建立ELISA方法的特异性。

将ASFV阳性血清按照2倍倍比稀释(1∶4 ～1∶2 048)，CD2v-ELISA的检测血清稀释倍数为100，因而阳性血清最终稀释倍数为1∶400 ～ 1∶204 800。同时利用其他ASF抗体检测试剂盒(国产1、国产2、进口1、进口2)分别检测，试剂盒检测的血清稀释倍数依次为100，50，20，20，对检测阳性的血清最大稀释倍数进行比较，评估所建立的方法的敏感性。

用同一批次包被的酶标板检测6份血清，每个血清6次重复，计算其变异系数(CV)以评价所建立的ELISA方法的批内重复性；用3个不同批次包被的酶标板检测6份血清，每份血清重复3个孔，计算其变异系数(CV)以评价所建立ELISA方法的批间重复性。

1.7 CD2v-ELISA临床样本的检测应用本研究建立的CD2v-ELISA方法检测来自ASFV监测阳性的养殖场收集的血清154份，评估该建立的方法临床应用的效果。将检测结果与来自4个ASF ELISA抗体检测试剂盒检测结果进行比较，计算该方法与其他方法的结果符合率。

2 结果

2.1 CD2v蛋白表达纯化及鉴定结果将测序鉴定正确的重组质粒转入表达菌株BL21(DE3)plyS中，获得重组菌CD2v-ELISA/BL21(DE3)pLysS。挑取单菌落，IPTG诱导后经超声波破碎菌体，获得上清和沉淀，取上清过镍柱纯化。经过SDS-PAGE胶电泳结果显示，诱导的重组菌在略小于25 kDa处有目的条带，表达量较高，与预期相符合。表达蛋白在上清液和包涵体中都有目的条带，主要存在于上清液中。纯化后的蛋白可以见到与目的蛋白大小一致的单一条带，说明获得纯度较高的目标蛋白。对纯化的蛋白进行Western blot鉴定，目的蛋白处有特异条带，说明表达及纯化的蛋白具有跟血清中特异性抗体反应的能力(图1)。

M.蛋白Marker；1.未诱导的pET28a-CD2v/BL21(DE3)pLysS;2.诱导的pET28a-CD2v/BL21(DE3)pLysS;3.纯化后的CD2v蛋白图1 CD2v蛋白诱导表达SDS-PAGE(A)及Western blot 分析(B)

2.2 ELISA方法的建立及反应条件的优化优化确定抗原包被质量浓度和血清的最佳稀释倍数，结果抗原包被最佳质量浓度为0.5 mg/L，血清稀释倍数为1∶100时，P/N值最大。根据P/N值选择羊抗猪HRP-IgG最佳的工作浓度为1∶100 000，底物显色时间为10 min。优化后的反应条件见表1。

表1 CD2v-ELISA检测方法的反应条件优化结果

图2 阴性样品结果正态分布图

2.4 ELISA方法的特异性用建立的方法对PRRSV、CSFV、PRV(gE)、PRV(gb)、FMDV、PCV阳性血清各5份进行检测，结果均为阴性，表明用CD2v蛋白建立的ELISA方法特异性良好(表2)。

表2 CD2v-ELISA的特异性试验结果

2.5 ELISA方法的敏感性血清按照2倍倍比稀释，CD2v-ELISA能检测血清稀释度为1∶12 800，说明该方法的检测敏感性较高(表3)。与其他试剂盒敏感性比较，建立的ELISA方法低于试剂盒国产1、国产2和进口2，高于进口1(表4)。

表3 CD2v-ELISA的阳性血清敏感性试验

表4 CD2v-ELISA与商品化试剂盒敏感性比较

2.6 方法的重复性批间重复性试验用3个不同批次的抗原包被ELISA板，检测6份临床血清，每份血清重复3孔；批内重复试验用同一批CD2v蛋白包被的酶标板，6份血清进行检测，重复3孔。批间、批内重复变异系数分别为5.23%～7.38%和2.46%～8.98%，两者均小于10.00%(表5)，说明所建立的方法具有较好的重复性。

表5 CD2v-ELISA重复性试验

2.7 CD2v-ELISA方法临床样品检测结果采用建立的CD2v-ELISA方法对154份临床血清进行了检测，结果有74份阳性样品，阳性率为48.05%。采用商品化试剂盒国产1、国产2、进口1和进口2 的检测样品阳性结果分别为77，77，64，82份，样品阳性率分别为50.00%，50.00%，41.56%，53.25%。本研究建立的ASFV CD2v抗体ELISA检测方法和2个国产ASF抗体检测试剂盒，符合率为94.16% 和95.45%，与进口品牌ASF抗体检测试剂盒相比符合率为88.13%和93.15%，说明所建立的方法与现有的试剂盒有较高的符合率(表6)。

表6 CD2v-ELISA与其他4种试剂盒对比符合率结果 %

3 讨论

ASF自2018年传入我国后，在国内不断蔓延和变异，猪群临床疫病情况日趋复杂，为更好地了解猪群临床疫病发展形势，ASF的检测需要结合临床抗体结果。本研究利用生物软件分析CD2v的跨膜区，表达了截短的CD2v重组蛋白作为包被抗原，获得了纯度较高的CD2v重组蛋白。且通过优化包被抗原的浓度、血清稀释倍数及对反应条件的优化，成功建立了敏感、特异和稳定的血清CD2v抗体的ELISA检测方法。

CD2v蛋白在ASFV BA71V感染的细胞中可检测到3种形式的表达，分别为89 kDa的全长糖基化蛋白，及约为63 kDa的N末端糖基化片段和约为26 kDa的C末端非糖基化片段[12]。CD2v 是在感染过程中诱导表达的，是ASFV感染晚期表达蛋白，在未感染的细胞中并不能检测到CD2v的存在[12]。在感染Vero细胞的ASFV粒子蛋白质组分析中，检测到CD2v蛋白丰度较低，而核壳蛋白PP220、PP62及其衍生物和衣壳蛋白P72占据蛋白总量的2/3[13]。尽管CD2v蛋白占据ASFV蛋白总量不多，CD2v蛋白在ASF的感染过程中上调表达，被认为可以识别细胞因子AP-1 从而增强病毒的感染性[14]。因而，有可能通过检测CD2v血清抗体，来判断ASF的感染。本研究使用原核表达的CD2v胞外区段蛋白，较为幸运地获得了该蛋白在上清中的表达，使得后续的蛋白纯化更为容易。该蛋白能很好的与感染血清抗体反应，证实了原核表达CD2v蛋白的胞外区段与血清抗体有较好的结合能力，进而可以进一步使用该蛋白建立ELISA抗体检测方法。

常用于ASF抗体检测的结构蛋白有P30、P54和P72。衣壳蛋白P72 是第1个被鉴定的病毒蛋白，能在感染动物中诱导产生抗体，还有P30和P54也被鉴定为强免疫原性的蛋白，检测这3种蛋白的抗体也是目前商品化ASF检测试剂盒最常采用的策略[15]。本研究建立的ELISA检测CD2v蛋白抗体，其敏感性稍低于检测结构蛋白P30、P54和P72蛋白抗体的试剂盒，可能是由于感染血清中CD2v蛋白抗体的丰度稍低于早期表达蛋白P30、P54和P72蛋白抗体。应用该方法检测临床感染血清，检测结果与国产及进口试剂盒相比，具有相对较高的符合率，说明CD2v抗体在感染血清中也具有较高的丰度，该蛋白具有检测的应用价值，建立的方法可以应用于临床样品的检测。

CD2v蛋白是ASF疫苗研究的重要候选蛋白，CD2v亚单位疫苗或联合其他蛋白的亚单位疫苗、重组载体疫苗、基因缺失疫苗都具有一定的保护作用[16-17]。因而也有必要建立ASF CD2v蛋白的抗体检测方法，为日后可能的疫苗应用做好技术储备。本研究成功建立了CD2v抗体ELISA方法，在临床血清应用中与已有的ASF抗体检测试剂盒有较好的符合率。在临床日益复杂的情况下，检测CD2v抗体为了解临床发病情况和ASF综合防控提供更多的数据依据和新的技术手段。