非洲猪瘟病毒在饲料中的传播风险

宋海杰，张彦华，张 娜，陶艺庆，吴 星，司素锦，田亚东 (河南农业大学 动物科技学院 河南省鸡种质资源创新与利用重点实验室，河南 郑州 450046)

非洲猪瘟病毒(Africa swine fever virus，ASFV)是一种有囊膜的双链DNA病毒，可以在真核细胞的细胞质中完全或部分复制，并具有自我修复能力[1]。在非洲、亚洲和欧洲广泛流行[2]，对养猪生产、生猪产业链及社会经济产生了重大影响[3]。近几年其跨地区传播风险进一步升级，尤其对历史上从未发生过的地区，如2018年中国、比利时被侵袭[4-5]，2019年越南、老挝、缅甸、菲律宾[6]被侵袭，2020年德国[7]、朝鲜[8]、韩国[9]、印度[10]被侵袭，2021年马来西亚[11]被侵袭，其流行趋势和传播风险有增无减。ASFV通过多种途径传播，包括直接接触受感染的家猪或野猪[12]以及间接接触污染物及食用受污染的饲料、泔水、饮水等等[13-14]。由于目前仍没有安全有效的疫苗[15-17]，养猪业主要通过严格的生物安全措施来防控非洲猪瘟(ASF)[18]，通过控制入场的动物、人员、物料、车辆、虫害等[19]风险来防止病原进入农场。然而，通过对2013—2014 年猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)在整个北美的侵入和传播的研究，推测饲料可能是一种污染物，饲料供应链可能有助于传播病毒[20]。也是基于PEDV在北美的流行，改变了养猪生产者和饲料制造商的思维，进而更加关注将生物安全防控扩展到饲料及饲料相关链条,最近的一些研究也显示饲料在ASFV的传播上发挥着重要作用[21-23]。目前中国的养猪企业绝大多数在使用商业饲料，商业饲料在进入猪的口中之前，需经历的过程包括：饲料厂采购原料、饲料厂加工原料成为商品饲料、商品饲料运输到物流中转站、物流中转后运输到饲料经销商、经销商运送饲料至养殖场，整个过程中如果饲料出现了污染，都会成为ASFV传播的风险[24-25]。因此，了解饲料原料、饲料加工环境及运输过程中的ASFV传播风险至关重要，基于此，现重点阐述以上几个方面的研究进展，以期为我国猪场生物安全体系建设、阻断ASF传播、健全猪场ASF防控提供参考。

1 ASFV在饲料原料中的存活及传播风险

饲料原料作为商业饲料重要的组成成分，其受到污染的风险直接关系到商品饲料的安全。ASFV具有很强的适应能力，血液中的病毒在4℃以下可持续存活超过525 d，在冷冻的肉、皮肤和脂肪、内脏中能分别持续存活1 000，300，155 d[26]。动物源性副产品如猪血浆蛋白粉、肉骨粉，已普遍被认为是猪病毒污染和传播的潜在高风险。WEN等[27]对辽宁某公司生产的20批及河北某公司生产的1批猪血浆蛋白粉进行检测，均检测到了ASFV核酸阳性，并进行了基因测序，发现和Pig/HLJ/2018具有相同的基因组序列，虽然无法从检测的血浆蛋白粉中分离出活病毒，但这并不意味着国内使用的猪血浆蛋白粉中ASFV都已被灭活。尽管ASFV在受污染的猪肉及其产品和血液中的高稳定性已经得到证实和重视，但其在植物性饲料原料中的稳定性最近才逐渐得到认可，尤其是谷物类饲料原料，在种植、收获、加工及后加工过程中都可能存在污染的风险。例如大田作物在收获前如果接触过受感染的野猪、收获后干燥的谷物在道路上晾晒而被污染的车辆碾压、作物产区的土壤或灌溉水被来自野猪的尸体/粪便或受感染家猪的粪便中的ASFV污染，则谷物可能会受到污染[28]。研究也已表明ASFV在一些常见谷物上可以存活一定的时间[29]。STOIAN等[29]通过30 d的模拟饲料原料跨大西洋运输，并对不同原料接种了ASFV，发现ASFV在普通豆粕、有机豆粕、豆饼、胆碱、猪肉肠衣及全价饲料上的平均半衰期分别为9.6，12.9，12.4，11.9，13.1，14.2 d，相较于普通基质中的半衰期，饲料中病毒的半衰期更长，也反映出饲料基质能够提供增加ASFV稳定性的环境。目前尚未有研究来确定ASFV是否能在商品饲料中使用的各种矿物质中存活。然而，从感染ASFV的野猪尸体埋葬地点收集的土壤样本中能检测到ASFV的DNA[30]。此外，虽然土壤的pH值、结构和温度会影响ASFV在不同土壤中的稳定性，但ASFV在无菌沙子中仍能存活3周以上，在沙滩上能存活2周，在庭院的土壤中能存活1周[31]。因此检测饲料原料以防控ASF暴发至关重要，也有研究机构开发了使用饲料粉尘作为饲料中 ASFV是否遭受污染的检测诊断工具[32]。

2 ASFV在饲料加工及运输中的传播风险

我国商业饲料的销售主要采用分销方式，了解饲料场加工环境的污染至关重要。研究证实了Georgia 2007毒株通过饲料感染猪只的最小剂量为104TCID50，通过饮水的最小感染剂量为100TCID50，且随着饲料和液体剂量的增加，感染的可能性增加[33]。与水源相比，饲料可能构成更大的威胁，因为饲料输送和采食是一种高频率事件，并且随着接触次数的增加，通过受污染饲料感染的可能性会急剧增加[33]。有研究对越南的1个饲料厂进行采样检测，共采集饲料厂中的环境拭子202份，其中1份(地面样品)ASFV核酸阳性，阳性率0.5%，采集饲料及饲料配料52份，检测结果均为阴性；另一项研究于2018年11月到2019年2月ASFV流行期间，对中国的3家商业性饲料厂进行了ASFV的PCR采样检测，在所有5 646份全价料样品中阳性率为0.5%～1.2%，5 364份饲料原料(包括玉米、小麦、大米、豆粕、面粉、麸皮、砻糠等样品)中阳性率为0.2%～1.8%。在原料阳性样品中，1份来自玉米，4份来自大米，6份来自麸皮，3份来自豆粕[34]。

在一项评估受ASFV污染后饲料批次间交叉污染及对环境影响的研究显示，在污染批次的饲料加工完成后，后续4批饲料仍能检测到ASFV阳性，且在和饲料直接接触表面(如混合机、提升机)、小于1 m的非接触表面(如混合机旁边的墙壁)、大于1 m的非接触表面(如距离混合机较远的墙壁)、移动的表面(如人员的鞋底)等环境样品中均能检测到ASFV 阳性，且移动表面检出的ASFV的DNA量最高[22]，这反映出ASFV一旦进入饲料厂环境，传播风险便不仅限于某批次污染的饲料，而是可能会持续存在于多批次的饲料中，且进入饲料厂环境中的病毒会很快扩散，污染生产设施及周围环境，而人员的流动可以显著促进ASFV在饲料厂环境中的传播。在之前对PEDV传播的研究中，同样发现移动的物体(如饲料、卡车)及人员也能促进病毒的传播[35]。此外，如果怀疑饲料厂环境中存在病毒污染，可以通过环境拭子进行检测，在ASFV暴发的区域，也可将环境拭子采样检测纳入饲料厂安全管理中，以了解饲料厂环境的潜在污染情况，便于及时采取措施。

车辆是饲料运输过程中最容易被污染的，JORDAN等[36]从饲料厂经过清洗消毒后的生猪运输车辆上采集了112个拭子样本进行检测，发现驾驶室内部表面采集的40个样本中有4个(10.0%)为阳性，从车辆外部表面采集的72个样本中，包括猪接触表面和车轮中没有阳性，车辆整体平均高达13.6%的阳性率。通过北美暴发PEDV原因的研究，研究者开始意识到运输过程中的饲料与疾病传播之间有着潜在联系，受污染的饲料及包装袋可能是美国PEDV暴发的根本原因[20]。此后，兽医、养殖场、饲料厂开始致力于使用预防性的生物安全策略来防止病原通过饲料供应链传播[37]。而养猪场的生物安全措施应扩展到饲料厂，以限制病原体通过饲料供应链传播的可能性。饲料厂的成品运输车辆的路线应避免与原料运输车辆的路线交叉，并实施严格的物理隔离以控制人员和车辆路线的交叉。同时应对进入饲料厂的车辆及转载运输车辆进行清洗消毒。而良好的生物安全管理体系是阻止病原体进入的有效措施[31]，国内对ASF的防控也把运输车辆作为重点的管控对象。

3 饲料中缓解ASFV的潜在解决方案

确保饲料安全的潜在解决方案主要包括生物性处理、物理性处理、化学性处理等不同类型的缓解策略，或单独使用这些策略，或组合使用以减少饲料中潜在的ASFV污染。生物处理通常使用特定的酶或其他微生物来源的产品来攻击病毒，但缺乏研究来证实这是否是饲料制造业可行的缓解策略。

饲料生产中的物理处理通常通过加热实现，也有研究显示，使用加热的方式可以降低PEDV在饲料中的存活率[38]，但需注意的是病毒的热灭活受病毒的毒株、滴度、饲料基质特性(如pH、水分、脂质和蛋白质含量)的影响。目前国内很多养殖企业是通过80℃高温制粒3 min的方式灭活病毒，但这种方式存在时间局限性，因为其不能防止加工后的污染风险，此外，长时间的加热势必会对饲料中维生素、酶、氨基酸、益生菌等营养物质造成一定的破坏[39]。另外一种是通过延长饲料的存储时间，来降低ASFV在不同饲料原料、商品化饲料中的存活率，但也同样面临营养物质流失的问题[40-41]。

使用化学试剂，也是目前研究比较多的一种方式，一些研究评估了在 ASFV 污染的饲料中添加中链脂肪酸、单甘油月桂酸酯和甲醛作为化学缓解剂，并显示出在降低饲料ASFV含量方面的有效性[42]，但在解释来自化学缓解剂评估研究的病毒灭活数据时应谨慎，或许缓解剂可能有效灭活体外培养细胞中的ASFV，但将其添加到饲料成分中时可能无效[43-44]。此外，在评估缓解研究的结果时，应考虑缓解水平和分析方法中存在的技术挑战。另外，一些缓解剂可能需要以液体形式应用于干燥的饲料成分才能产生效果，这可能会引起猪场负责人对促进霉菌和细菌生长的担忧。ZHAI等[45]通过在实验室环境中模拟ASFV对饲料的污染，验证出纯的苯甲酸和百里香酚、丁香酚、胡椒碱、姜黄素的组合可以降低饲料中ASFV的生存能力和病毒载量，该解决方案可作为降低ASFV污染饲料风险的预防措施，其潜在的处理病毒机制可能与破坏病毒囊膜有关[27]。但使用化学添加剂时，病毒的灭活并不意味着病毒的核酸被破坏掉，这应被视为诊断饲料中ASFV是否具有感染性的重要因素[46]。也有研究显示，一些植物天然提取物如芹黄素、芫花黄素、金雀异黄素、杨梅酮和杨梅苷、白藜芦醇等在体外也表现一定的抗ASFV活性[47]，但缺乏动物体内验证试验，其安全性及体内的有效性无法保证，另外植物提取物工艺复杂，提取后的稳定性、活性，及对活体动物的效果，均需要进一步深入研究。

4 总结及展望

ASFV可以通过多种途径传播，且能在多种饲料原料以及商品化饲料中存活，饲料已经被证明是ASFV传播的潜在媒介，一旦ASFV进入饲料厂，便会在饲料加工环境中迅速扩散，而运输车辆、人员在ASFV传播风险中承担着重要角色,在目前尚未有安全有效疫苗的情况下，猪场可以考虑采用一些物理性或者化学性的方法来降低ASFV在饲料中的传播风险，但需要辩证、谨慎的看待和应用。

为了更好地了解猪饲料中ASFV的传播风险、预防控制措施，需要进行更加深入的研究，尤其在缓解策略、净化策略上。同时饲料企业应积极主动地寻找方法评估、监测以及构建ASFV防控体系，从源头上降低ASFV在饲料中的传播风险，在未来饲料厂的改造和新建中，可考虑把生物安全防控设计进去，这也是未来维持饲料生物安全的关键。