基于网络药理学和分子对接探究葛根芩连汤“异病同治”结直肠癌和2型糖尿病作用机制

张欣怡，林翔，刘希樵，张烁，黄宣

1.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江 杭州 310053；2.浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病率在全球消化道恶性肿瘤中居第3位。根据其症状，与中医“便秘”“泄泻”“便血”等相关，主要由于先天不足、饮食失节或外邪入侵等因素导致正气亏虚，脾胃失健，湿热毒邪积聚肠道所致。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）属中医学“消渴”范畴，是由于先天亏虚或后天饮食失节等，导致肺、脾、肾三脏阴液亏虚，水谷精微纳运失常，进而出现多食、喜饮、多尿等典型症状。“异病同治”是指采用同一方法治疗具有相同病机的不同疾病。葛根芩连汤出自《伤寒论》，由葛根、黄芩、黄连、甘草组成，用于治疗太阳风寒表虚误用下法后，肠胃损伤，邪热入里，热迫大肠而下利之证，后世主要用于治疗邪热下迫大肠引起的肠鸣腹泻等。临床表明，葛根芩连汤对于CRC和T2DM均有较好的疗效。Li 等发现，服用葛根芩连汤的CRC患者腹痛、腹泻、里急后重等症状得到明显改善。Lv等通过试验发现，经葛根芩连汤治疗后的小鼠瘤体尺寸明显小于对照组，表明葛根芩连汤有抑制CRC肿瘤细胞生长的作用。Meta分析结果表明，葛根芩连汤对T2DM疗效确切。Xu等研究显示，葛根芩连汤对糖尿病大鼠有明显的降糖作用。目前对于葛根芩连汤治疗CRC与T2DM共同机制的研究相对不足。本研究运用网络药理学及分子对接方法探索葛根芩连汤治疗CRC和T2DM的共同作用机制，为中医“异病同治”的深入研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分筛选及其靶点获取

通过TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）及中医药整合药理学研究平台（TCMIP，http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）检索葛根芩连汤组方药物葛根、黄连、黄芩、甘草的化学成分，根据TCMSP药代动力学参数（ADME），以口服生物利用度（OB）≥20%和类药性（DL）≥0.1作为标准筛选活性成分。通过TCMSP检索活性成分相关靶点。使用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/），获得靶点对应标准基因名（gene symbol），物种筛选条件为“human”。

1.2 疾病靶点及交集靶点获取

通过TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）、OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，以“colorectal cancer”“rectal cancer”“colon cancer”为关键词检索CRC 相关靶点，以“type 2 diabetes”“diabetes mellitus,type 2”为关键词检索T2DM相关靶点。删除重复靶点后，使用Draw Venn Diagram 在线分析工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）获得葛根芩连汤与CRC 和T2DM的交集靶点。

1.3 药物-成分-靶点网络构建

将交集靶点与活性成分导入Cytoscape3.8.2软件，利用Analyze Network 功能进行拓扑分析，计算度值（degree）及介数中心性（betweenness centrality），并以节点度值大小为主要依据构建药物-成分-靶点网络。

1.4 蛋白相互作用网络构建及核心靶点分析

将交集靶点导入STRING 数据库（https://www.string-db.org/），设定物种为“Homo sapiens”，设定最低蛋白质互作可信度为0.7，隐藏网络中孤立靶点，得到蛋白相互作用（PPI）网络，保存为tsv文件。利用Cytoscape3.8.2软件Analyze Network功能对靶基因进行拓扑分析，然后使用其CytoHubba插件，筛选度值排名前50位靶点，作为潜在作用靶点，进行后续分析。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

将交集靶点导入Metascape 数据库（https://metascape.org/gp/index.html），选择物种为“H.sapiens”，个性化分析（Custom Analyse），进行GO功能和KEGG通路富集分析。筛选条件为≤0.01，将分析结果按值从小到大排列，利用微生信在线作图工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化分析。

1.6 分子对接

选取潜在作用靶点PPI网络中度值排名前5位靶点作为受体蛋白，取关联靶点数排名前5位的活性成分作为配体小分子，进行分子对接。从RCSB PDB数据库中找到靶蛋白的3D结构模式，保存为“PDB”格式文件。从TCMSP下载5种活性成分的结构模式，保存为“MOL2”格式。使用AutoDockTools1.5.6软件对受体蛋白和配体小分子进行去水分子、添加非极性氢、计算蛋白质结构的电荷、搜索配体分子的可旋转化学键等操作，并输出为PDBQT格式文件。根据受体与配体的结构大小设定合适的对接盒子及对接参数，设定对接形式为半柔性对接，即受体蛋白设置为刚性，配体分子设置为柔性。根据受体-配体结合能选取部分对接结果，利用PyMOL软件进行可视化分析。

2 结果

2.1 葛根芩连汤活性成分与靶点

通过TCMSP数据库检索及筛选，共得到葛根芩连汤活性化学成分204种，包括葛根7种、黄连21种、黄芩51种、甘草125种，其中8种为共有成分。OB值前30位活性成分见表1。通过TCMSP数据库检索对应靶蛋白，通过UniProt数据库检索对应靶蛋白名称，去重并校对后得到333个作用靶点。

表1 葛根芩连汤主要活性成分（OB值前30位）

2.2 疾病靶点及交集靶点

检索GeneCards、TTD、DrugBank、OMIM 数据库，经筛选及合并去重后得到CRC相关靶点3 323个、T2DM相关靶点3 301个，将葛根芩连汤治疗2种疾病的靶点取交集，得到210个交集靶点，即葛根芩连汤“异病同治”2种疾病的潜在作用靶点，见图1。

图1 葛根芩连汤治疗CRC和T2DM交集靶点韦恩图

2.3 药物-成分-靶点网络

由葛根芩连汤活性成分及药物与疾病交集靶点构建药物-成分-靶点网络，包括369个节点和2 091条边，节点分别为210个交集靶点、4种药物和155种活性成分。关联靶点数前5位活性成分为槲皮素（Quercetin）、芹菜素（Apigenin）、山柰酚（Kaempferol）、葛根素（Puerarin）、汉黄芩素（Wogonin）。此类成分为多目标和多效应化合物。槲皮素关联靶点数最多，为123个。研究表明，槲皮素可改善糖脂代谢紊乱，能通过免疫激活和增加细胞黏附而促进癌细胞凋亡。PTGS2（前列腺素内过氧化物合酶2）关联的活性成分数量最多，有137种。前10位活性成分见表2。药物-成分-靶点网络见图2。

图2 葛根芩连汤治疗CRC和T2DM药物-成分-靶点网络

表2 葛根芩连汤治疗CRC和T2DM药物-成分-靶点网络度值前10位活性成分

2.4 交集靶点蛋白相互作用网络及核心靶点分析

通过STRING数据库，设置蛋白互作可信度≥0.7，获得包含210个节点和2 120条边的网络，其中孤立靶点4个。将该网络以TSV格式导入Cytoscape3.8.2进行拓扑分析。使用该软件的Cytohubba插件，选取度值前50位靶点构建PPI网络（见图3），该网络由50个节点、670条边组成。AKT1（RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）、IL6（白细胞介素6）、TP53（肿瘤蛋白P53）、MAPK8（丝裂原激活蛋白激酶8）、VEGFA（血管内皮生长因子A）、TNF（肿瘤坏死因子）是葛根芩连汤治疗CRC和T2DM的潜在核心靶点。度值前30位靶点及其拓扑分析结果见表3。

表3 葛根芩连汤治疗CRC和T2DM交集靶点PPI网络前30位靶点拓扑分析

图3 葛根芩连汤治疗CRC和T2DM交集靶点PPI网络

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析得到生物过程（BP）2 622条，细胞组分（CC）133条，分子功能（MF）206条。值前10位条目见图4。交集靶点主要参与毒性物质反应、创伤应激、对无机物质的反应、凋亡信号通路等生物过程，主要分布于胞膜、囊泡空腔、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物等细胞组分，与调控蛋白激酶、转录因子和细胞因子受体等物质的结合及活性、调节磷酸转移酶活性等分子功能关联性较大。

图4 葛根芩连汤治疗CRC和T2DM靶点GO功能富集分析

KEGG通路富集分析得到通路375条，值前20位通路见图5。交集靶点主要作用于癌症、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF和IL-17信号通路、内分泌抑制和Th17细胞分化等通路，与上述通路关联最多的靶点为AKT1。

图5 葛根芩连汤治疗CRC和T2DM靶点KEGG通路富集分析

2.6 分子对接结果

一般认为，分子对接结合能小于0 kcal/mol表明两者之间对接良好，结合能数值越小表明两者之间的结合越紧密。度值前5 位的核心靶蛋白分别为AKT1、TP53、IL6、MAPK8、TNF，关联靶点数前5位的活性成分分别为槲皮素、芹菜素、山柰酚、葛根素和汉黄芩素。运用AutoDockTools软件对核心靶点与主要活性成分进行分子对接，结果各靶点与活性成分的对接结合能均小于0 kcal/mol，表明受体蛋白与配体小分子之间均存在良好的结合活性，分子对接结果见表4。TP53蛋白较其他蛋白与活性成分之间有较高的结合活性，选取TP53与5种配体小分子之间的结合通过PyMOL进行可视化分析，结果见图6。

表4 核心靶点与主要活性成分分子对接平均结合能（kcal/mol）

图6 TP53与葛根芩连汤核心成分分子对接模式

3 讨论

“异病同治”是重要的中医治则，相关研究证实该理论用于临床的正确性。CRC与T2DM在病机上都存在脾胃运化失调，水谷精微输布失常的特点。葛根芩连汤方中葛根有生津止渴、健脾升阳止泻之功，黄芩和黄连有清热解毒燥湿之力，甘草有补中调脾胃之效，临床用于T2DM和CRC疗效确切。研究发现，T2DM与CRC在发病、诊断、治疗等方面关系密切，T2DM会影响CRC的早期筛查。长期服用降糖药可以改善CRC术后患者的预后，延长其生存期。有数据显示，二甲双胍可提高CRC患者的生存率，同时改善T2DM合并CRC患者的免疫微环境和肠道微环境。相关数据分析也发现，葛根芩连汤存在对CRC和T2DM的治疗靶点。本研究基于中医“异病同治”理论，以网络药理学为分析工具，从葛根芩连汤治疗CRC和T2DM的共同靶点出发，分析其核心靶点及通路。

通过分析交集靶点的PPI网络，得出AKT1、IL-6、TP53等是葛根芩连汤治疗CRC和T2DM的潜在核心靶点。AKT1是AKT的主要亚型之一，是调节细胞存活信号通路的中心节点，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）是AKT的上游蛋白，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mTOR是AKT1的下游蛋白，三者组成的PI3K/AKT/mTOR轴是介导肿瘤生长代谢与转移的经典途径，能促进肿瘤细胞的蛋白质等物质合成，抑制细胞自噬等分解代谢。研究表明，该信号通路能通过增强瓦伯格效应（Warburg effect）维持肿瘤细胞的能量补给，并在上皮间质转化过程（EMT）中发挥重要作用，促进CRC细胞的转移。AKT1是T2DM的重要治疗靶点。Yin等通过病例对照研究发现，AKT1/AKT2基因变异患者T2DM 的发病率明显升高，提示PI3K/AKT/mTOR可能参与了T2DM的发病过程。研究表明，胰岛素是PI3K/AKT 途径调节物质代谢的主要配体，PI3K/AKT信号途径激活能使过量葡萄糖转移至胞外用于组织吸收，可以减轻肥胖和胰岛素抵抗，并且有调节糖尿病患者肠道菌群的作用。Toda 等发现，AKT1/AKT2敲除会导致与胰岛素受体敲除类似的糖异生基因表达增加和糖耐量受损的现象。本研究KEGG通路富集分析结果显示，PI3K/AKT/mTOR途径是葛根芩连汤治疗CRC和T2DM的重要通路。

IL-6可由人体多种细胞产生，在高压或应激状态下主要通过棕色脂肪组织产生并持续维持在较高水平，能促进肝脏糖原异生，导致机体血糖升高。酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）和信号传导与转录激活因子3（STAT3）是IL-6的下游靶点，IL-6/JAK2/STAT3是致癌信号通路之一，IL-6分泌增多引起STAT3升高，会抑制多种抗肿瘤细胞的成熟活化，诱导肿瘤免疫抑制，并通过影响间充质干细胞增殖促进CRC的转移。研究表明，靶向IL-6可增强肿瘤特异性Th1反应，靶向IL-6或STAT3联合免疫治疗可提高抗肿瘤疗效。

除上述核心靶点外，其余靶点对葛根芩连汤治疗CRC和T2DM也可能发挥作用。VEGFA能促进CRC微血管生成，是影响CRC转移的重要因子。雌激素受体1（ESR1）能促进葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）表达，并提高胰岛素敏感性，改善血糖稳态。上述研究进一步论证了中药复方多靶点协同治疗疾病的特色。

分子对接结果显示，AKT1、IL-6、TP53等核心靶点与槲皮素、芹菜素、葛根素等葛根芩连汤的核心成分结合程度良好。可视化分析显示核心成分与TP53之间有紧密的化学键连接，也进一步证明葛根芩连汤可能通过槲皮素、葛根素等成分作用于TP53、AKT1等核心靶点，进而对CRC和T2DM起到改善作用。

GO功能和KEGG通路富集分析结果显示，葛根芩连汤治疗CRC和T2DM主要涉及调节细胞因子、影响激素分泌与物质代谢、细胞的分化成熟凋亡等机制，提示葛根芩连汤在调节炎症反应方面有一定的作用。此外，葛根芩连汤可能通过调节转录因子的活性，影响蛋白质及酶类的合成代谢，继而影响癌细胞的生长或转移，同时影响糖酵解、糖原异生等重要糖代谢途径，在血糖稳态中发挥重要作用。在激素分泌方面，葛根芩连汤可能通过PI3K/AKT信号途径改善胰岛素抵抗进而发挥降糖作用。

综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接方法对葛根芩连汤“异病同治”CRC与T2DM的作用机制进行蛋白与通路层面的分析，表明葛根芩连汤的成分与CRC和T2DM的共同靶点之间存在良好的化学连接，葛根芩连汤可能通过调节细胞炎症因子表达、介导物质代谢、影响细胞存活/凋亡途径等共同途径治疗CRC与T2DM，且与PI3K/AKT、IL-6/JAK2/STAT3等信号通路密切相关，可为中医“异病同治”理论及临床治疗CRC和T2DM提供分子依据。但本研究仅为生物信息学数据分析，仍需后续研究进一步完善相关机制的论证。