麻元通便止痛汤调控AMPK/eNOS信号通路改善大鼠慢传输型便秘的作用机制

谢昌营 余绪超 葛巍 吴成成 肖慧荣 林申奇 刘金连

关键词麻元通便止痛汤;慢传输型便秘;AMPK/eNOS信号通路;作用机制

慢传输型便秘（slow-transmission constipation，STC）主要是因肠道蠕动功能及传输速度下降而引起的一种临床常见疾病，其主要表现为大便干燥、排便困难、排便次数及便意减少[1-2]。目前，该病的发病率呈逐年上升趋势，且该病患者常伴有腹胀，日常生活备受影响，患者情绪也愈发焦虑，极易诱发其他基础性疾病。因此，STC 已成为一个公共健康问题[3]。目前，该病的发病机制还不够明确，许多研究结果也并未对其进行深入探索，因此，临床一般多采用泻药或者促肠胃蠕动的药物进行治疗，但是此类药物一般存在不良反应。由此可知，寻找有效且安全的药物是目前亟待解决的问题。

麻元通便止痛汤是专业医师通过多年研究而得，并已在临床中证实该方具有润肠通便、止痛止血的功效[4]。近年来研究发现，STC 的发生与能量代谢紊乱密切相关，其中AMP活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）作为能量代谢调节的中枢，可调节蛋白质代谢、脂质代谢、糖类代谢、自噬和线粒体稳态，对生理代谢活动具有重要意义[5-6]。内皮型一氧化氮合酶（endothelialnitric oxide synthase，eNOS）是抑制胃肠道运动的重要分子，其涉及的eNOS/一氧化氮（nitric oxide，NO）信号通路是AMPK的重要下游信号[7]。eNOS 是一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的亚型之一，也是NO合成的关键酶;NO作为一种消化道抑制性神经递质，主要作用于胃肠道平滑肌，可抑制平滑肌收缩，减少胃肠道蠕动[8]。由此推测，AMPK/eNOS信号通路对STC具有一定调控作用。但是麻元通便止痛汤是否可以通过调控AMPK/eNOS 信号通路治疗STC 尚不明确。因此，本研究建立STC 大鼠模型，观察麻元通便止痛汤对大鼠STC 的改善效果，并初探其作用机制，以期为该病的临床治疗提供新的思路。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有TDL-5-A 型高速离心机、Type T2A 型全自动凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司），DYY-12C 型电泳仪[大龙兴创实验仪器（北京）有限公司]，FSH-2A型组织匀浆机（江苏常州朗越仪器制造有限公司），WGLL823BE型恒温箱（天津市泰斯特仪器有限公司），BP310P 型称量天平（德国Sartorius 公司），BX53 型显微镜（日本Olympus 公司），RT-6100 型酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

麻元通便止痛汤由江西中医药大学附属医院中药房自制（取火麻仁30 g、苦杏仁10 g、大黄6 g、郁李仁20 g、厚朴10 g、枳壳20 g、生地20 g、玄参20 g、槐花10 g、地榆10 g、延胡索12 g、白芍10 g、甘草10 g 加1 500 mL水熬煎，熬至400 mL即可）;其他主要药品与试剂有磷酸盐缓冲液（PBS，成都中仕石化有限公司，批号2026067），石蜡（瑞沃德生命科技有限公司，批号69019361），NO、NOS 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批號分别为20190310K8、218360343），eNOS 分析试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号PL107]，兔源AMPK多克隆抗体、兔源eNOS多克隆抗体、兔源哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）多克隆抗体、兔源结节性硬化复合物1（tuberous sclerosiscomplex 1，Tsc-1）单克隆抗体、兔源Tsc-2 单克隆抗体、兔源真核启动因子4E 结合蛋白（4E binding protein，4ebp）多克隆抗体、兔源GAPDH多克隆抗体（上海碧云天生物科技有限公司，批号分别为AF1617、AF1587、AF1627、AF2677、AF6792、AF5812、AF1186），羊抗兔免疫球蛋白G二抗（美国Abcam 公司，货号211-035-109）;其余试剂为实验室常用规格，水为纯净水。

1.3 动物

本研究所用SD雄性大鼠50 只，9 周龄左右，体质量约260 g，购自北京科宇动物养殖中心，实验动物生产许可证号为SCXK（京）2018-0010。大鼠饲养于无菌环境中，温度为27 ℃，湿度为55%，自由进食，适应性喂养1周后进行实验。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

将大鼠分为空白组、模型组和麻元通便止痛汤低、中、高剂量组，每组10 只。参照文献[9]方法进行造模：除空白组外，其余各组大鼠均灌胃2.5 mg/L 复方地芬诺酯混悬液（0.02 mL/g）进行造模，每日1 次，连续2 周。当大鼠体质量增长缓慢、粪便颗粒减少且干硬、精神较差时提示造模成功。本实验所有大鼠均造模成功。造模成功后第2 天，麻元通便止痛汤低、中、高剂量组大鼠分别灌胃麻元通便止痛汤6、12、18 mg/kg（根据前期预实验结果设置[10]，以生药量计），模型组与空白组大鼠均灌胃等体积生理盐水，每天1 次，连续2 周，给药期间所有大鼠自由饮食。

2.2 大鼠粪便数量及含水率的检测

收集各组大鼠治疗前（制备STC 模型前14 d）和治疗后（药物治疗期间14 d）每天的全部粪便，计算粪便总数量，并称质量（即湿粪质量）。然后将全部粪便置于恒温箱中烘烤，烘烤温度为90 ℃，时间为3 h，烘干后再次称粪便质量（即干粪质量），计算粪便含水率[粪便含水率=（湿粪质量-干粪质量）/湿粪质量×100%]。

2.3 大鼠炭末推进率的检测

大鼠治疗结束0.5 h 后，将2 mL质量浓度为50 g/L的炭末悬浊液灌入大鼠胃中，25 min 后处死大鼠，将小肠（幽门至回盲部）取出，自然平铺于桌面上，自由伸展后测量小肠总长度及炭末混悬液在小肠内推进的距离，然后计算炭末推进率（炭末推进率=炭末推进距离/小肠总长度×100%）。

2.4 大鼠结肠组织的病理观察

采用苏木精-伊红（HE）染色法观察。各组大鼠取结肠组织3 块，用生理盐水冲洗肠内容物后，将其中2 块组织置于10%甲醛溶液中保存;另外1 块组织装入冻存管中，置于-80 ℃冰箱中保存，用于后续实验。将于10%甲醛溶液中保存的结肠组织以流水冲洗并用乙醇脱水，再将该组织置于既溶于乙醇、又溶于石蜡的透明剂中，放入保温箱中;待石蜡完全浸入组织后进行包埋、切片（5 μm）、染色，然后采用显微镜观察各组大鼠结肠组织的病理学变化。

2.5 大鼠结肠组织中NO、NOS水平的检测

采用ELISA 法检测。取各组大鼠冻存的结肠组织适量，置于液氮中，然后将其剪碎倒入匀浆管中匀浆，离心收集上清液，根据试剂盒说明书相关方法检测大鼠结肠组织中NO、NOS的水平。

2.6 大鼠结肠组织中AMPK/eNOS信号通路相关蛋白表达水平的检测

采用Western blot 法检测。取各组大鼠冻存的结肠组织适量，加入裂解液裂解，以14 000 r/min 离心15min，取上清液，以BCA 法测定蛋白含量。蛋白经煮沸变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转膜，以5%脱脂奶粉封闭1 h;以TBST洗膜10 min×4次，加入AMPK、eNOS、mTOR、Tsc-1、Tsc-2、4ebp、GAPDH一抗（稀释度均为1 ∶1 000），4 ℃孵育过夜;以TBST 洗膜10 min×4 次，加入二抗（稀释度为1 ∶2 500），室温孵育2 h;以TBST洗膜10 min×4次，加入ECL试剂显色5 min，采用全自动凝胶成像仪显影曝光。采用Image J v1.8.0软件对条带灰度值进行分析，以目的蛋白与内参GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

2.7 麻元通便止痛汤中活性成分的筛选

麻元通便止痛汤中的君药包括火麻仁、枳壳、生地，其中火麻仁具有润肠、滑肠的功效，枳壳行气消积，生地泄肠道实火、泻下攻积，三者相辅相成[9]。为研究麻元通便止痛汤中活性成分与AMPK/eNOS信号通路的关联，笔者首先通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，网址为http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）检索麻元通便止痛汤中火麻仁、枳壳、生地的活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18 作为筛选条件，筛选麻元通便止痛汤中活性较高的成分，并参考文献[11]进行补充，即得麻元通便止痛汤的活性成分。

2.8 麻元通便止痛汤中活性成分与AMPK、eNOS的分子对接分析

选择麻元通便止痛汤君药各药材Degree 值最高的活性成分进行分子对接[12]。检索并下载TCMSP数据库中活性成分的2D结构和3D结构，采用YASARA分子模拟软件经去H2O、加H质子化和添加缺失原子后，运用PyMOL、AutoDockVina等软件进行分子对接。

2.9 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料以x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 大鼠粪便数量、含水率及炭末推进率的检测结果

治疗前后，与空白组比较，模型组大鼠粪便数量、含水率及炭末推进率均显著减少或降低（P<0.05）。治疗后，与模型组比较，麻元通便止痛汤各剂量组大鼠粪便数量、含水率及炭末推进率均显著增加或升高（P<0.05）。与治疗前比较，麻元通便止痛汤各剂量组大鼠粪便数量及含水率均显著增加或升高（P<0.05）。结果见表1。

3.2 大鼠结肠组织病理观察结果

HE染色结果显示，空白组大鼠结肠组织结构清晰，黏膜上皮结构较好，细胞排列整齐均匀;模型组大鼠结肠组织结构紊乱，肌层较薄，黏膜下层见大量炎症细胞浸润;麻元通便止痛汤各剂量组大鼠结肠组织结构逐渐清晰，黏膜下层炎症细胞浸润明显减少，且随剂量的增加，黏膜排列结构和肌层厚度与空白组差异不大。结果见图1。

3.3 大鼠结肠组织中NO、NOS水平的检测结果

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中NO、NOS水平均显著升高（P<0.05）。与模型组比较，麻元通便止痛汤各剂量组大鼠结肠组织中NO、NOS（麻元通便止痛汤低剂量组除外）水平均显著降低（P<0.05）。结果见表2。

3.4 大鼠结肠组织中AMPK/eNOS信号通路相关蛋白表达水平的检测结果

与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中AMPK、eNOS、mTOR、Tsc-1、Tsc-2、4ebp 蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。与模型组比较，麻元通便止痛汤各剂量组大鼠结肠组织中上述指标表达水平均显著降低（P<0.05）。结果见表3、图2。

3.5 麻元通便止痛汤活性成分的筛选结果

麻元通便止痛汤的君药包括火麻仁、枳壳和生地，设置OB≥30%，DL≥0.18，同时去除无对应靶点的成分，最终筛选出火麻仁活性成分6 种、枳壳活性成分5种、生地活性成分2 种，结果见表4。

3.6 麻元通便止痛汤活性成分与AMPK、eNOS的分子对接结果

根据Degree 值得出火麻仁中评分最高的活性成分为（Z）-3-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-N-[2-（4-hydroxyphenyl）ethyl]acrylamide，枳壳中评分最高的活性成分为nobiletin，生地中评分最高的活性成分为stigmasterol等。运用PyMOL、AutoDockVina 等软件对AMPK、eNOS 蛋白进行分子对接，并测定结合能。结果显示，AMPK 与（Z）-3-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-N-[2-（4-hydroxyphenyl）ethyl]acrylamide 的结合能为- 5.15kJ/mol，与nobiletin 的结合能為-4.61 kJ/mol，与stigmasterol的结合能为- 4.83 kJ/mol;eNOS 与（Z）-3-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-N-[2-（4-hydroxyphenyl）ethyl]acrylamide 的结合能为-6.11 kJ/mol，与nobiletin 的结合能为-5.40 kJ/mol，与stigmasterol 的结合能为-5.91kJ/mol。具体结合模式见图3、图4。

4 讨论

STC是病因极为复杂的疾病，且随着社会经济的发展、生活节奏的加快及精神压力的加重，该病的发病率也越来越高[13]。现有的研究对该病发生的病理生理机制并不深入，治疗方法虽然较多，但是效果并不理想。除此之外，已有研究指出，许多患者存在抑郁和焦虑等问题，且与病情发展密切相关[14-15]。因此，该病的治疗越来越受到临床关注。中医认为STC 属于“便秘”的范畴。在《诸病源候论·大便难候》中也有记载“大便难者，由五脏不调，阴阳偏有虚实，谓三焦不和则冷热并结故也”，并指出该病的病因与机体脏腑的寒热虚实有关[16]。本研究中的麻元通便止痛汤由中药火麻仁、苦杏仁、大黄、郁李仁、厚朴、枳壳、生地、玄参、槐花、地榆、延胡索、白芍、甘草组成，其中火麻仁、苦杏仁、郁李仁共同增强润肠、滑肠的功效;大黄、生地泄肠道实火，泻下攻积;厚朴、枳壳行气消积;玄参清胃肠虚热的同时，解大黄药性的峻烈;槐花、地榆止血;延胡索、白芍止痛;甘草清热解毒，调和诸药;最终达到润肠攻积、行气清热、止血止痛的功效[13]。本课题组前期研究已证实，麻元通便止痛汤对便秘有明确疗效，但是具体机制并不明确[17]。已有研究表明，AMPK/eNOS 信号通路可以抑制內皮细胞氧化应激反应和炎症反应，从而促进内皮修复，发挥抗炎、抗凋亡的作用[18-19]。其中，抑制eNOS信号通路可减少结肠组织中NO、eNOS 的含量，从而抑制平滑肌收缩，减少胃肠道的蠕动[20-21]。目前，尚未有相关研究提到此通路与STC有相关性，基于此，本研究针对AMPK/eNOS 信号通路研究麻元通便止痛汤改善STC 的作用机制。

STC主要因肠道传输减慢，导致粪便在肠道中滞留过久，水分重吸收增加，致使大便干硬、排便时间延长、粪便排出困难。目前STC 的发病机制尚不明确。本研究首先观察了大鼠治疗前后粪便数量和含水率的变化，结果显示，治疗后，与模型组比较，麻元通便止痛汤各剂量组大鼠粪便数量及含水率均显著增加，表明麻元通便止痛汤可改善大鼠便秘情况。而经麻元通便止痛汤干预后，大鼠炭末推进率显著增加，表明麻元通便止痛汤可改善大鼠的肠道蠕动功能。此外，本研究还观察了大鼠的结肠组织病理变化，结果显示，经麻元通便止痛汤干预后，大鼠结肠组织结构逐渐清晰，黏膜下层炎症细胞浸润明显减少，且随剂量的增加，黏膜排列结构和肌层厚度与空白组差异不大，表明麻元通便止痛汤对STC的疗效较好。而经麻元通便止痛汤干预后，大鼠结肠组织中NO、NOS水平显著降低，表明该药可能对大鼠胃肠道功能有一定的改善作用。

研究发现，Tsc-1、Tsc-2 是mTOR活性调控的关键抑制因子，活化后的Tsc-1、Tsc-2 可以抑制mTOR的活性，从而抑制细胞生长;其次，mTOR可进一步激活其下游因子4ebp，发挥调节下游蛋白翻译的作用[22 - 23]。而AMPK 位于mTOR 的上游，AMPK 的活化可正向促进mTOR的表达，但mTOR、Tsc-1、Tsc-2、4ebp 是否也可参与调控STC 尚不明确。基于此，笔者采用Western blot法同时检测大鼠结肠组织中AMPK、eNOS、mTOR、Tsc-1、Tsc-2、4ebp 蛋白的表达水平，结果显示，经麻元通便止痛汤干预后，大鼠结肠组织中上述蛋白表达水平均显著降低。这表明，麻元通便止痛汤可通过抑制AMPK/eNOS 信号通路改善STC 模型大鼠的便秘症状及肠道功能。

火麻仁、枳壳和生地为麻元通便止痛汤的君药，分子对接分析结果显示，火麻仁、枳壳、生地中Degree 值评分最高的活性成分分别为（Z）-3-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-N-[2-（4-hydroxyphenyl）ethyl]acrylamide、nobiletin、stigmasterol，这3 种成分与AMPK的结合能分别为-5.15、-4.61、-4.83 kJ/mol，与eNOS的结合能分别为- 6.11、- 5.40、- 5.91 kJ/mol，且这3 种成分与AMPK、eNOS 的构象稳定、结合活性较高，进一步说明麻元通便止痛汤对STC模型大鼠的改善作用与AMPK/eNOS信号通路有关。

综上所述，麻元通便止痛汤可改善STC模型大鼠的便秘症状和肠道功能，其作用机制可能与抑制AMPK/eNOS信号通路有关。