Spinophilin的表达与垂体腺瘤侵袭性的关系

阳 荣 牟 吉 周 龙 田仁富

垂体腺瘤（pituitary adenoma，PA）是常见的颅内良性肿瘤[1]，但部分PA呈侵袭性生长，称为侵袭性PA，可侵犯海绵窦、颅骨和颈内动脉等，手术治疗效果较差[2]。PA侵袭性涉及多种基因及信号通路的异常，蛋白磷酸酶调节底物的磷酸化在瘤细胞增殖、侵袭过程中发挥重要作用[3，4]。Spinophilin（SPN）是从神经元树突棘中分离出来的，定位于染色体17q21.33 ，与蛋白磷酸酶1及F肌动蛋白存在相互作用[5]。SPN参与突触可塑性、细胞骨架组装和细胞内信号转导，与阿尔茨海默症、帕金森病和胶质瘤等中枢神经系统疾病的发生、发展有关[6～8]。既往研究发现SPN与肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移有关[9]。本文探讨SPN在PA中的表达及其与肿瘤侵袭性的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入标准：①术前未接受放、化疗；②组织病理学检查证实为PA；③年龄≥18岁。排除标准：①合并其他部位肿瘤；②存在急慢性感染性疾病；③合并严重肝肾脏疾病；④合并免疫系统疾病。

2018年8月至2021年6月收治符合标准的PA共98例，其中64例获取瘤旁组织（距腺瘤组织≥2 cm）。98例中，男53例，女45例；年龄21岁～72岁，平均（49.23 ±11.29 ）岁；肿瘤直径8～65 mm，平均（34.27 ±10.03 ）mm；混合型20例，生长激素型12例，泌乳素型24例，促肾上腺皮质激素型9例，无功能型33例。根据Knosp分类法[10]：侵袭性46例，非侵袭性52例。

1.2 免疫组化染色检测SPN的表达PA组织和瘤旁组织经10%福尔马林固定，石蜡包埋、切片由本院病理科制作，厚度为1.5 μm。常规脱蜡后，进行抗原修复。PBS洗涤3次后，加入SPN抗体（1 000:1，美国Sigma公司）37℃孵育1 h，随后温室放置30 min。PBS洗涤两次后加入二抗，37℃孵育20 min，洗涤2次。进行DAB显色（武汉卡诺斯科技有限公司），避光下观察，3 min内终止显色。最后用苏木素（上海懋康生物科技有限公司）复染1 min，脱水、封片。显微镜下观察，细胞呈棕黄色为SPN阳性表达（图1）。将阳性细胞百分比评分（阳性细胞百分比＜5%、6%～25%、26%～50%、≥51%，分别计0、1、2、3分）与染色强度评分（无染色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别计0、1、2、3分）相乘，≤2分为阴性，≥3分为阳性[11]。

1.3 荧光定量PCR检测SPN mRNA表达水平 用TRIzol试剂（上海源叶生物科技有限公司）提取组织总RNA。通过反转录获取cDNA，随后用荧光定量试剂盒（美国Sigma公司）进行检测，操作步骤按照试剂盒说明书进行，用2-△△Ct法计算SPN mRNA相对表达量。引物序列：SPN上游5′-GGCGATCATACTGGGAGATG-3′，下游5′-TGTGATTCAAGTTGGGGTCA-3′；内参GAPDH上游5′-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3′，下游5′-AAAGGTTGTTCTCCACTC TCTCAC-3′。

1.4 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件处理；计量资料以x±s表示，用t检验；计数资料用χ2检验；应用多因素logistic回归模型分析侵袭性的影响因素；用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析SPN mRNA判断PA侵袭性的价值，计算曲线下面积（area under curve，AUC）、灵敏度和特异度；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PA组织SPN的表达水平PA组织SPN阳性表达率（21.43 %，21/98）明显低于瘤旁组织（71.87 %，46/64；P＜0.05 ）。侵袭性PA组织SPN阳性表达率（13.04 %，6/46）明显低于非侵袭性PA组织（28.85 %，15/52，P＜0.05 ）。混合型PA组织SPN阳性表达率为30.00 %（6/20）、生长激素型为25.00 %（3/12）、泌乳素型为20.83 %（5/24）、促肾上腺皮质激素型为22.22 %（2/9）、无功能型为15.15 %（5/33），各种类型PA组织SPN阳性表达率无统计学差异（P＞0.05 ）。PA组织SPN mRNA相对表达量（1.21 ±0.37 ）明显低于瘤旁组织（2.89 ±0.75 ；P＜0.05 ）。侵袭性PA组织SPN mRNA相对表达量（0.73 ±0.16 ）明显低于非侵袭性PA组织（1.68 ±0.80 ；P＜0.05 ）。

2.2 PA侵袭性的影响因素 单因素分析显示，肿瘤大小、增殖水平、SPN表达水平与PA侵袭性有关（P＜0.05 ，表1）。多因素logistic回归分析显示，肿瘤直径＞3 cm（OR=4.103 ；95%CI 1.351 ～10.672 ；P＜0.001 ）、Ki-67增殖指数高（OR=1.675 ；95%CI 1.271 ～3.802 ；P＜0.05 ）、SPN阴性表达（OR=2.876 ；95%CI 1.003 ～5.121 ；P＜0.001 ）是PA侵袭性的独立危险因素。

2.3 SPN mRNA预测PA侵袭性的价值ROC曲线分析显示，SPN mRNA预测PA侵袭性的AUC为0.830 （95%CI 0.813 ～0.916 ；P＜0.001 ），诊断临界值为0.84 ，灵敏度和特异度分别为95.23 %和83.12 %，见图2。

图1 免疫组化染色检测组织SPN表达（×200）

表1 本文98例垂体腺瘤侵袭性危险因素的单因素分析

图2 ROC曲线分析SPN mRNA预测垂体腺瘤侵袭性的效果

3 讨论

PA属于良性肿瘤，部分PA具有侵袭性。PA侵袭性受多种因素影响。本文发现肿瘤直径和Ki-67增殖指数是PA侵袭性密切相关。这与既往报道一致[11，12]。本文还发发现，SPN低水平表达与PA侵袭性有关。SPN是黏度信号蛋白，在人体多种组织中均有表达，特别是在脑组织（脑皮质、海马和尾壳核）中表达丰富[13]。SPN可以与磷酸酶PP1结合，又被称为PPP1R9B，可能参与肿瘤进展[14]。研究发现SPN在肺腺癌细胞中低表达，与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移密切相关[15]。SPN不仅与PP1结合，在脑组织中还与黏附分子、细胞骨架蛋白等多种蛋白相互作用，参与突触可塑性、细胞骨架组装和细胞内信号转导，与阿尔茨海默症、帕金森病和胶质瘤等中枢神经系统疾病的发生发展有关[6，7，13]。研究发现SPN可以调节胶质母细胞瘤的侵袭性，下调SPN可以增强肿瘤细胞侵袭性，并且促进细胞外基质降解[16]。本文发现，PA组织SPN表达水平明显低于瘤旁组织，表明SPN可能在PA中发挥抑癌基因的作用。本文还发现侵袭性PA组织SPN阳性表达率明显低于非侵袭性PA组织；并且侵袭性PA组织SPN mRNA相对表达量明显低于非侵袭性PA组织；多因素logistic回归分析显示，SPN阴性表达是PA侵袭性的独立危险因素；ROC曲线分析显示SPN mRNA水平预测PA侵袭性的AUC为0.830 ，诊断临界值为0.84 ，灵敏度和特异度分别为95.23 %和83.12 %。这提示SPN mRNN水平判断PA侵袭性具有较高的价值。

总之，PA组织SPN呈低表达，检测SPN表达水平对PA侵袭性有一定评估作用。