马腺疫链球菌新疆株2种新SeM基因型的鉴定及其遗传变异分析

张 欢，张泽华，吕芬芬，汪 丽，蒲小峰， 张宝江，苏 艳

(新疆农业大学 动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

马腺疫是一种马属动物的常发传染病[1]，以发热、上呼吸道黏膜炎症、下颌淋巴结肿胀化脓为特征[2-3]。该病在世界范围流行，马腺疫链球菌(Streptococcusequisubsp.equi，S.equi)是引起该病的病原菌，是C群链球菌的成员[4]。该病目前仍困扰世界养马业[5-6]。

seM蛋白是位于S.equi菌体表面一种耐热耐酸的纤维蛋白，是该菌重要的毒力因子和保护性抗原[7]，能够与纤维蛋白原及免疫球蛋白IgG结合，抑制吞噬细胞的吞噬功能并参与机体的免疫调理功能[8-9]。由于环境、宿主免疫压力的影响使seM蛋白的N端不断变异并表现出序列多样性，不同地区马腺疫链球菌分离株的seM蛋白N端序列往往会有明显的差异[10-11]。目前，SeM基因的多样性已成为对该病进行菌株来源分析及疾病流行病学分析的重要指标[12-13]。SeM基因分型是依据该基因在不同菌株之间的多态性而建立的基因分型方法，不仅可以在全球数据库中对分离菌株进行比对分析，还可跟踪分离菌株流行演化特征，有利于对该病的有效防控。

16S rRNA基因具有良好的保守性，16S rRNA基因序列分析已成为细菌分类系统中最有用和最常用的研究工具[14]，也可用于细菌性疫病的分子流行病学研究[15]。新疆马腺疫频繁发生，已造成严重的经济损失[16]。本研究对从新疆伊犁地区分离鉴定的2株S.equi(Z422、JMC111)进行生化及药敏特性检测，并对菌株进行16S rRNA基因序列分析和SeM基因分型，从全球基因数据库层面了解和掌握S.equi新疆地方株基因型的特点，以期为新疆地区马腺疫的有效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

无菌采集新疆伊犁某马场发病马匹的下颌肿胀组织及分泌液，从2个马场分别采集病样12份及15份。PCR扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。营养肉汤培养基、TH培养基、琼脂粉、细菌微量生化反应管、药敏试纸，均购自杭州滨和微生物试剂有限公司；基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；DL2000 DNA Marker、2×TaqDNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分离培养与染色镜检 将无菌采集的病料分别划线接种至鲜血固体培养基上，37 ℃培养18 h后，挑取疑似单菌落进行纯化培养，观察分离菌的生长状态并挑取单菌落进行革兰氏染色。显微镜观察细菌的染色及形态学特征。

1.2.2 生化试验 将分离菌加入细菌微量生化反应管中37 ℃恒温培养18～24 h，观察颜色变化并记录结果。根据《链球菌生化编码鉴定手册(GYZ-12St)》对分离菌进行初步鉴定分析。

1.2.3 药物敏感性试验 采用纸片扩散法，将分离菌菌液均匀涂布于MH固体培养基表面，将含有抗生素的药敏片贴放于培养基表面，37 ℃培养18 h后测量抑菌圈直径，重复3次，记录数据。依据临床和实验室标准化委员会(CLSI)药敏结果判定标准进行判定。用于检测的抗生素有21种，包括阿莫西林、氨苄西林、头孢呋辛、头孢噻呋、头孢西丁、青霉素、庆大霉素、链霉素、红霉素、克拉霉素、多西环素、左氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、磺胺异恶唑、磺胺嘧啶钠、利福平、克林霉素、土霉素和四环素。

1.2.4 16S rRNA的PCR扩增与分析 挑取分离菌纯培养单菌落接种于肉汤培养基，37 ℃培养并收集菌体，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。用表1引物进行16S rRNA基因的PCR扩增。PCR扩增体系(25 μL)：上、下游引物各1 μL、2×TaqMix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、模板2 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s， 35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经电泳检测回收后进行测序。测序结果通过Blast与GenBank中马链球菌相关参考序列进行比对，利用DNA Star软件构建系统发育树。

1.2.5SeM基因的PCR扩增与分析 基因组DNA提取方法同“1.2.4”。用表1引物进行SeM基因的PCR扩增。PCR扩增体系(25 μL)：上、下游引物各1 μL、TaqDNA聚合酶12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、模板2 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸105 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经电泳观察后，将目的条带回收并测序。SeM基因测序结果在PubMLST-seM数据库中比对进行SeM基因型的鉴定，与该库中马链球菌马亚种其他相关序列进行blast比对分析并构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 分离菌的形态学特征

从病样中分离到2株疑似菌，分别命名为：Z422和JMC111。2株分离菌在鲜血琼脂培养基上生长良好，菌落周围出现透明的溶血圈(图1)。革兰氏染色后，显微镜下观察可见蓝紫色的单个或链状分布的革兰氏阳性球菌(图2)。

图1 分离菌在鲜血琼脂培养基上形成的菌落形态Fig.1 Colony morphology of isolated bacteria formed on blood AGAR medium

2.2 生化试验

将分离菌分别接种于生化反应管，经培养后菌株Z422与JMC111均可发酵吡咯烷酮、精氨酸、甲基丙烯酰基、髓磷脂连接糖、曲美他嗪、蔗糖，不能发酵二苯基膦、七叶苷、葡磷、蕈糖、山梨醇，初步判定分离菌为马链球菌，生化反应结果见表2。

图2 分离菌革兰氏染色镜检形态(1 000×)Fig.2 Gram staining morphology of isolate(1 000×)

2.3 药物敏感性分析

药敏结果显示(表3)，分离菌Z422对21种抗菌药物中的7种(阿莫西林、氨苄西林、头孢呋辛、青霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶钠和四环素)药物耐药，对3种(红霉素、克林霉素和土霉素)中度敏感，对其他药物均高度敏感。菌株JMC111对21种抗菌药物中的3种(头孢呋辛、青霉素、克拉霉素)药物耐药，对1种(氨苄西林)中度敏感，对其他药物高度敏感。

2.4 16S rRNA基因的扩增与序列分析

2株分离菌的16S rRNA基因经PCR扩增后，目的条带约1 050 bp(图3)，对PCR产物测序和比对后，显示分离菌Z422及JMC111与S.equi的同源性为99.9%。将测序结果上传到GenBank数据库，获得序列号分别为：JMC111：MT815606、Z422：MT815607，基于16S rRNA基因的序列比较(图4)和系统进化树(图5)，可将所有比较菌株分为3个群，其中本研究中的两株分离菌Z422及JMC111归属 Ⅰ 群，Ⅱ 群和 Ⅲ 群均为马链球菌兽疫亚种。比较结果还发现，分离菌所在的 Ⅰ 群菌株的16S rRNA基因在V5区具有特征性的序列。

表3 药敏试验结果Table 3 Microbial susceptibility test results

2.5 SeM基因的扩增及序列分析

分离菌Z422、JMC111的SeM基因PCR扩增后,目的条带约1 560 bp(图6)，测序后在马链球菌SeM基因库中比对鉴定得到两个新基因型(图7)，菌株seM 208(JMC111)和seM 209(Z422)。分离菌与马链球菌马亚种参考菌株SeM基因型的系统进化树分析结果显示，这2株分离自不同马场的菌株亲缘关系较远。分离株seM 209(Z422)与seM 195、seM 196亲缘关系接近。分离株seM 208(JMC111)与seM 112、seM 7亲缘关系接近。

对seM 蛋白N端氨基酸分析比较结果(表4)表明，与参考菌株S.equi4047相比，分离菌seM 208(JMC111)在N端第37～143 Aa 间发生2个氨基酸的变异，而分离于不同马场的seM 209(Z422)在N端第37～143 Aa 间发生6个氨基酸的变异。

M. DL 2000 DNA标准; 1.Z422; 2. JMC111; 3.阴性对照

3 讨 论

马腺疫一直困扰着世界各国马产业的发展，近年来随着新疆地区马养殖业的快速发展，马腺疫频繁发生。2011年新疆地区发生的马腺疫，发病率达到80%～90%，当年生马驹的发病率高达100%[17]。

目前对S.equi分离株seM进行基因分型和遗传进化分析已成为研究该病分子流行病学的重要手段。国外对于S.equi分离株进行的分子水平的基因分型和遗传进化研究较多，国内该方面的信息缺乏，不利于对该病的防控提供流行病学数据。

seM蛋白N端第37位至第183位的变异与该菌对免疫压力和环境的适应性密切相关。通过对58株S.equi分离株的序列分析发现，21个核苷酸的变异共导致18个氨基酸的取代，这些证据表明seM处于多样化的选择压力[18-19]。本研究通过比较2株分离菌seM蛋白N端的氨基酸序列，发现突变主要发生在第37位～第143位的21个氨基酸中。刘云涛等[20]2015年对新疆地区的5株S.equi流行菌株进行了seM蛋白序列的比较分析，与参考菌株S.equi4047 seM蛋白的N端多变区进行对比，在这些菌株的seM蛋白的N端区第47位～第176位共存在6个氨基酸的变异(Aa 47、52、57、58、62、125)。

与参考菌株比较，分离菌株seM 208(JMC111)在SeM基因的N端第47位～第125位氨基酸位点之间共有2个氨基酸(Aa58、Aa107)的差异，seM 209(Z422)则有6个氨基酸的差异(Aa 52、62、70、81、113、122)，2015与2019年新疆地方流行株seM蛋白的N端可变区氨基酸的变化特点表明这些马源菌株SeM基因随着时间发生着多样性的变化。

研究证明，以编码SeM蛋白N端多变区的基因为依据进行基因分型和进化分析可为S.equi分子流行研究提供重要的工具[10-12,18-19]。SeM基因分型就是一种根据该基因N端的序列变化对不同的S.equi菌株进行分型的方法，采用该方法可以通过网络数据库对世界各地的流行菌株序列进行比较，为研究S.equi菌株在世界范围内的流行提供公共数据[13]。Ivens等[21]对145株英国2010年的分离株进行了比对分析，共发现了23个不同的基因型，根据遗传距离的远近又将其分为4个群：seM 9 group群、seM 6群、seM 8群及seM 3群。John等[22]根据研究结果推测，编码seM蛋白N端氨基酸的基因不断变异会导致新的基因型产生，这一区域的变异还可帮助S.equi逃避宿主的非特异性免疫但不会干扰宿主的特异性免疫。

图4 马链球菌16S rRNA基因序列中V1～V5可变区比对结果Fig.4 Comparison of 16S rRNA gene sequences in V1-V5 region

图5 根据16S rRNA序列构建的马链球菌系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on sequence of 16S rRNA

M. DL 2000DNA Marker; 1.阴性对照 2. Z422; 3.JMC111

刘云涛等[20]2015年根据seM全基因分析新疆地区流行株的流行特点发现，5株流行株可分为2群，一群与美国流行株亲缘关系较近，另外一群显示出本地流行株的特点。2019年，周婷婷等[23]对2013-2017年分离的10个新疆流行株的SeM基因与国外分离株构建系统进化树，发现根据SeM基因序列比较这些菌明显分布于4个群的2个群中，该结果与刘云涛等[20]的研究结果基本一致。本次2019年新疆地方株JMC111和Z422分别鉴定为seM新基因型seM 208和seM 209，这两株菌在同一时间分别流行于同一地区的2个不同的马场内，根据本研究建立的seM等位基因系统发育树，发现seM 208型与2006年英国seM 7基因型流行株亲缘关系最近，seM 209型与2020年英国seM 195、seM 196基因型流行株亲缘关系较近。该结果表明在该地区同一年中不同马场流行的菌株由于马匹流动的不同情况，可同时存在着不同的基因型，该结果可为制定该病的预防措施提供一定的依据。

最近国外学者对埃及阿拉伯马中的S.equi流行株应用SeM基因型鉴定法进行分析发现，流行的菌株基因型主要有4种：seM 139、seM 140、seM 141及seM 199，通过溯源分析得出seM 139与seM 141中国驴源腺疫流行株基因型一致，seM 140与seM 199与欧洲马源腺疫流行株基因型一致[24]。

16S rRNA常被用于研究系统发育和各亚种之间的进化关系[25]，随着信息化的发展，核糖体数据库不断完善，已经建立了专门的 16S rRNA数据库，目前认为16S rRNA序列分析方法在未知细菌的鉴定和细菌的分型等领域具有广阔的应用前景。链球菌的分类可依据3种不同的方法,即溶血性分类法、兰氏分群法和种名分类法。其中种名分类法主要依据链球菌的形态、生理生化特性和16S rRNA序列分析等进行鉴定，是最被认可的一种分类方法。

图7 分离菌SeM基因与seM数据库中其他基因型菌株的系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree of isolates and other genotypes of S.equi in seM database

表4 seM蛋白的氨基酸序列比较Table 4 Comparison of amino acid sequence in seM protein

16S rRNA序列中含有可变区和恒定区，不同细菌可变区序列不同。有学者发现将16S rRNA序列分析方法应用到皖南花猪细菌性疫病流行病学调查研究是一种行之有效的方法，对该动物疫病防控具有重要作用[26]。本研究中，应用16S rRNA序列分析方法，发现马链球菌马亚种和兽疫亚种的分离株具有5个特征的可变区，并可分为3个不同的群，其中Ⅰ群具有特征性的V5区，Ⅱ群具有特征性的V2区。国外学者研究结果证明可通过V2区的序列变化与特征来研究马链球菌兽疫亚种的种内遗传变化[27-28]。本研究通过对2株分离株与国外分离株16S rRNA可变区的比较发现，可根据V1区的序列差异把Ⅰ群、Ⅱ群与Ⅲ群区别开，根据V2区的变化特征可把Ⅱ群、Ⅲ群与Ⅰ群区别开。本研究还发现V5区表现出特征性序列，该序列为S.equi菌株共同具有的特征，推测这可能为马亚种菌株的遗传进化特征之一，对V5区序列特征的发现国内外尚未见报道。

青霉素被认为是治疗马腺疫的首选药物[5]，本次药敏试验结果表明，分离菌对青霉素耐药，该结果与周婷婷等[23]的研究结果一致。此外本研究还发现两株分离菌对克拉霉素耐药，该结果表明本地区的马腺疫链球菌菌株正在对更多的药物产生耐药，这将导致对马腺疫的治疗变得更难，因此还应科学合理地使用抗生素，以便更好地治疗该病。