蚯蚓粪、草炭与生物炭混合对基质理化性质和细菌群落组成、代谢的影响

蔺玉红 马嘉伟 张雪艳

(宁夏大学 农学院，银川 750021)

无土栽培是设施园艺主要的栽培方式之一，无土栽培常选用草炭、蛭石和珍珠岩的混合材料作为基质，由于传统草炭不可再生，限制了无土栽培的快速发展。另外无土栽培中为节约成本，基质连茬使用现象普遍发生，传统基质在连作后会出现养分失衡、微生物群落结构单一化和功能多样性降低的现象，在一定程度上造成园艺作物产量和品质下降。因此，寻找适宜且可再生的基质资源，减少草炭资源的利用，对于促进资源可持续发展和无土栽培产业发展具有重要意义。

蚯蚓粪是蚯蚓对有机废弃物进行生物降解的产物，具有良好的团粒结构、孔性、透气性和较高的持水能力。蚯蚓粪中含有丰富的放线菌、细菌、真菌、植物生长激素和酶类。连作土壤施用适量蚯蚓粪后，能降低土壤容重，增加土壤总孔隙度和优化通气性能，解决土壤板结等问题，因此蚯蚓粪可用于缓解番茄、黄瓜和西瓜等经济作物连作障碍和促进土壤微生物生态系统修复。崔文静等研究发现，采用

V

(蚯蚓粪)∶

V

(蛭石)=1∶1的配方基质栽培的樱桃萝卜和茼蒿产量显著高于其它处理；刘青等研究发现添加20%蚯蚓粪的复合基质对西瓜的育苗效果最好。生物炭是一种由农业固体废弃物高温裂解产生的材料，因其原材料安全环保、自身理化特性利于聚集水分和吸附有害物质等特点，被广泛应用于农业研究。生物炭可影响土壤细菌群落结构及其丰度，调控土壤环境因子和微生物之间的互作关系，促进并改良微生物生态系统，从而对受微生物驱动的氮、磷、钾营养元素循环转化产生影响，最终改变土壤质量和功能。施用生物炭可改善土壤理化性质，间接影响土壤有益微生物活性，从而提高作物的肥料利用率及产量。添加生物炭使得土壤细菌和放线菌数量显著增加，恢复到初茬栽培的水平；Lehmann等研究表明，生物炭可改变土壤微生物数量及微生物群落结构，并且能够增强根部真菌的繁殖能力；邹春娇等发现经生物炭处理后，基质内细菌和放线菌数量在黄瓜定植30～90 d均有所增加。衡量无土栽培基质质量的一个重要方面是基质微生物环境，尤其是细菌的群落结构。细菌在土壤生态系统中直接或间接参与养分的代谢、转移和转化过程，因此细菌群落与基质理化性质间相互作用会影响土壤或者基质的养分环境，进而影响蔬菜品质和产量。

目前土壤中混施生物炭的应用效果研究已较为成熟，但将生物炭与草炭或蚯蚓粪混合作为无土栽培的基质，关于其对基质养分及基质微生物环境的作用的研究报道尚少。因此，本研究拟以黄瓜为研究对象，选择蚯蚓粪和草炭作为栽培基质，利用单因素、多因素方差分析和冗余分析等方法，系统比较这2种无土栽培基质中添加生物炭前后基质养分特性和微生物区系的变化，明确生物炭对草炭、蚯蚓粪基质中微生物结构和基质养分特性演变的影响，筛选适宜微生物生存且富含养分的基质，为高效利用生物炭和蚯蚓粪提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄瓜品种‘航瓜玉妮’购自神舟绿鹏农业科技有限公司。蚯蚓粪购自华盛绿能农业科技有限公司，以

m

(牛粪)∶

m

(秸秆)=25∶1的材料饲养蚯蚓获得蚯蚓粪，pH为7.61，EC为0.52 mS/cm，全氮含量0.45%，总有机碳含量11.80%。生物炭是玉米秸秆碳化获得，购自南京六合区南京勤丰秸秆科技有限公司，pH为9.67，EC为3.35 mS/cm，全氮含量0.93%，总有机碳含量38.93%。草炭购自宁夏中青生物科技有限公司，pH为6.46，EC为0.55 mS/cm，全氮含量0.33%，总有机碳含量21.63%。

1.2 试验方法

1

.

2

.

1

试验设计试验在宁夏吴忠市国家农业科技园区C4号日光温室(38°33′75″ N，106°38′54″ E)进行。进行两茬田间试验，秋茬(2018年9月30日—2019年1月18日)，春茬(2019年3月5日—7月7日)。试验设计草炭、草炭+生物炭(

m

(草炭)∶

m

(生物炭)=4∶1)、蚯蚓粪和蚯蚓粪+生物炭(

m

(蚯蚓粪)∶

m

(生物炭)=1∶1)共4个处理，每个处理重复5次。采用下挖槽式无土栽培，槽长×宽×深度为10.00 m×0.60 m×0.45 m，槽间设置2个保护行，避免处理间相互干扰，栽培“航瓜玉妮”水果黄瓜，株距20 cm，行距140 cm，各处理随机区组排列，小区面积70 m，统一采用滴灌进行水肥管理，整个生育期灌水量约180 t，肥料选用“海法魔粒丰”(N，16.0%；PO，32.0%；KO，32.0%；海藻提取素，0.5%)，“海法钾宝”(N，12.0%；PO；5.0%；KO，42.0%)。

1

.

2

.

2

测定方法基质养分指标测定：分别在2018年12月8日和2019年5月10日(两茬盛果期)取基质样品，风干过筛用于基质养分测定。pH采用酸度计测定(

m

(土)∶

V

(水)=1∶5)，电导率(EC)采用电导法测定，基质容重(BD)和总孔隙度(TP)根据文献的方法测定，全氮含量(TN)采用半微量凯氏定氮法，有机质含量(OM)采用重铬酸钾-硫酸氧化法。

基质细菌群落多样性测定：分别于2018年12月8日和2019年5月10日(两茬盛果期)采基质鲜样进行微生物群落多样性分析，委托上海派森诺生物科技有限公司测定。样品微生物总DNA利用快速提取试剂盒(MP Biomedicals, Santa Ana,美国)提取。采用通用的正向引物338F (5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3)和反向引物806R (5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)对细菌16S rRNA基因V3 V4区进行PCR扩增。扩增反应参照Sun等。PCR产物利用纯化试剂盒纯化(MP Biomedicals,美国)。DNA序列采用Illumina Miseq 平台(Illumina, Inc,美国) 和细菌群落分析。使用QIIME2在Greengenes数据库进行比对得到 OTUs 的分类学信息，得出物种对应的基因丰度和分类学水平上各样品中物种的丰度，从而构建相应分类学水平上的丰度谱，并计算出Chao1丰富度指数、Shannon多样性指数、Simpson指数和Pielou’s指数。默认使用MinPath推断代谢通路，进而获得各样本中代谢通路的丰度数据。

1.3 统计分析

所有数据重复3次。采用Execl 2010和SPSS 25.0 进行统计与分析，采用单因素和多因素ANOVA在

P

<0

.

05水平进行显著性分析。使用Origin Pro 2021和派森诺基因云网站进行绘图和冗余分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对黄瓜果实指标的影响

秋茬及春茬各处理的果实糖酸比和单果质量对比分析见图1。可知：2茬果实糖酸比均表现为蚯蚓粪和蚯蚓粪+生物炭处理显著低于草炭和草炭+生物炭处理，但蚯蚓粪与蚯蚓粪+生物炭处理之间、草炭和草炭+生物炭处理间无显著差异；春茬单果质量相较秋茬增加，秋茬中，草炭+生物炭处理相较草炭处理其黄瓜单果质量显著增加，蚯蚓粪和蚯蚓粪+生物炭间差异不显著，春茬蚯蚓粪处理果实单果质量最高，其他处理间无显著差异。

P，草炭；PB，草炭+生物炭；V，蚯蚓粪；VB，蚯蚓粪+生物炭。柱形上不同小写字母表示相同茬口间不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。P, peat; PB, peat+biochar; V, vermicompost; VB, vermicompost+biochar. Different lowercase letters on the column indicate significant differences among different treatments in the same crop (P<0.05). The same below.图1 各处理秋茬及春茬果实的糖酸比(a)和单果质量(b)Fig.1 Sugar-acid ratio (a) and single fruit weight (b) of autumn stubble and spring stubble of each treatment

2.2 不同处理对基质理化性质的影响

各处理秋茬及春茬基质的物理及养分指标分析结果见图2。可知：添加生物炭对蚯蚓粪和草炭的pH、EC、全氮和有机质均有显著影响，且茬口间存在差异：除蚯蚓粪+生物炭处理外，春茬其余处理全氮和有机质含量均显著高于秋茬；秋茬和春茬基质中，添加生物炭显著降低了蚯蚓粪的容重，提高了草炭pH和蚯蚓粪EC，提高了蚯蚓粪和草炭全氮和有机质含量。

图2 各处理秋茬及春茬基质的理化性质Fig.2 Physicochemical properties of substrates in autumn and spring stubble for each treatment

2.3 不同处理对基质细菌群落组成和代谢的影响

Greengenes数据库计算出各处理秋茬及春茬基质的细菌群落丰富度、多样性和均匀度指数见表1。可见：不同茬口的细菌群落多样性无显著差异，但不同基质的细菌群落多样性差异显著。在秋茬时，草炭添加生物炭对细菌群落结构有显著的提升效果，其Shannon、Simpson和Pielou’s指数均显著增加，Simpson和Shannon指数反映微生物多样性，Shannon值越大, 表明群落多样性越高，表明添加生物炭可提高草炭细菌群落多样性和均一度水平。

表1 各处理秋茬及春茬基质的细菌群落丰富度、多样性和均匀度指数
Table 1 Bacterial community richness, diversity and evenness index of autumn
and spring stubble substrates in each treatment

茬口Stubble处理TreatmentChao1指数Chao1 index辛普森指数Simpson index香农指数Shannon index均匀度指数Pielou index草炭6 122.06±277.76 a0.993±0.0003 c10.41±0.05 b0.836±0.005 b秋茬Autumn stubble草炭+生物炭6 296.32±160.95 a0.996±0.0004 b10.69±0.07 a0.856±0.003 a蚯蚓粪5 941.71±369.00 a0.998±0.0001 a10.54±0.09 ab0.853±0.001 a蚯蚓粪+生物炭5 407.64±339.19 a0.997±0.0001 a10.60±0.08 ab0.862±0.002 a草炭7 121.97±345.10 a0.999±0.0001 a11.26±0.046 a0.888±0.005 a春茬Spring stubble草炭+生物炭6 949.05±321.68 a0.999±0.0005 ab11.24±0.06 a0.889±0.005 a蚯蚓粪5 381.92±112.10 b0.998±0.0004 bc10.48±0.10 b0.854±0.005 b蚯蚓粪+生物炭5 854.99±63.85 b0.997±0.0003 c10.49±0.04 b0.848±0.002 b

注：同一茬口同一列不同小写字母表示在<005水平下处理间差异。下同。
Note: Different lowercase letters in the same column of the same crop season indicate the difference between treatments at <005 level. The same below.

所有处理中共检测到菌门49个，筛选出排名前15的菌门进行相对丰度的绘图(图3(a))。其中变形菌门(Proteobacteria)(38.70%)、放线菌门(Actinobacteria)(20.90%)、绿弯菌门(Chloroflexi)(14.18%)相对丰度均大于10%，为各处理中优势菌门。茬口对细菌群落有显著影响，相较秋茬，春茬中的酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)相对丰度有所增加， 分别增加45.54%、21.42%和14.60%，放线菌门(Actinobacteria)降低了35.20%；秋茬蚯蚓粪处理和蚯蚓粪+生物炭处理变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)丰度较草炭和草炭+生物炭处理低，绿弯菌门(Chloroflexi)反之；相较蚯蚓粪处理，蚯蚓粪+生物炭处理变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度显著增加，分别增加了6.42%和28.50%；相较未添加生物炭的草炭和蚯蚓粪处理，添加生物炭的处理厚壁菌门(Firmicutes)丰度显著提高。

P1.秋茬,草炭;PB1.秋茬,草炭+生物炭;V1.秋茬,蚯蚓粪;VB1.秋茬,蚯蚓粪+生物炭;P2.春茬,草炭;PB2.春茬,草炭+生物炭;V2.春茬,蚯蚓粪;VB2.春茬,蚯蚓粪+生物炭。下同。P1, autumn stubble, peat; PB1, autumn stubble, peat+biochar; V1, autumn stubble, vermicompost; VB1, autumn stubble, vermicompost+biochar; P2, spring stubble, peat; PB2, spring stubble, peat+biochar; V2, spring stubble, vermicompost; VB2, spring stubble, vermicompost+biochar. The same below.图3 各处理秋茬及春茬基质细菌群落门(a)和属(b)水平的相对丰度Fig.3 Relative abundances at the phylum (a) and genus (b) levels in the matrix bacterial communities of autumn and spring stubble for each treatment

排名前10属水平相对丰度如图3(b)所示。黄杆菌属(

Flavobacterium

)、德沃西亚属(

Devosia

)和假单胞菌属(

Pseudomonas

)为主导菌属。春茬的黄杆菌属(

Flavobacterium

)、假单胞菌属(

Pseudomonas

)和根瘤菌属(

Allorhizobium

)相对丰度显著高于秋茬；相较草炭，蚯蚓粪处理的德沃西亚属(

Devosia

)和根瘤菌属(

Allorhizobium

)相对丰度显著下降；春茬草炭+生物炭处理和蚯蚓粪+生物炭处理的黄杆菌属、德沃西亚属和假单胞菌属的相对丰度相较草炭和生物碳处理显著增加，分别增加了87.00%、24.40%和249.40%。

利用MinPath方法比对分析细菌代谢通路差异，结果见图4和表2。可知：连续试验两茬后4种处理具有≥21条代谢通路。细菌功能主要集中在代谢、遗传信息处理、环境信息处理和细胞进程四大类，其中代谢占主导。两茬代谢通路的相对丰度无显著差异；在代谢功能中，草炭处理和草炭+生物炭处理的脂质代谢和异生物素的生物降解与代谢的丰度均高于蚯蚓粪处理和蚯蚓粪+生物炭处理，而蚯蚓粪处理和蚯蚓粪+生物炭处理的辅助因子和维生素代谢、萜类和聚酮化合物代谢、其他氨基酸代谢和能量代谢以及遗传信息处理相关的功能丰度均高于草炭+生物炭处理与草炭处理。

表2 代谢通路分级名称
Table 2 Metabolic pathway classification designation

一级代谢通路Primary metabolic pathway二级代谢通路Secondary metabolic pathway细胞生长与死亡 Cell growth and death细胞进程Cellular processes细胞运动 Cell motility细胞社群 Cellular community运输和分解代谢 Transport and catabolism环境信息处理Environmental information processing信号转导 Signal transduction膜运输 Membrane transport翻译 Translation遗传信息处理Genetic information processing折叠,分类和降解 Folding, sorting and degradation复制和修复 Replication and repair转录 Transcription核苷酸代谢 Nucleotide metabolism聚糖的生物合成与代谢 Glycan biosynthesis and metabolism其他次生代谢产物的生物合成 Biosynthesis of other secondary metabo-lites能量代谢 Energy metabolism异生物素的生物降解与代谢 Xenobiotics biodegradation and metabolism代谢Metabolism脂质代谢 Lipid metabolism其他氨基酸的代谢 Metabolism of other amino acids萜类和聚酮化合物的代谢 Metabolism of terpenoids and polyketides辅助因子和维生素的代谢 Metabolism of cofactors and vitamins碳水化合物代谢 Carbohydrate metabolism氨基酸代谢 Amino acid metabolism

图4 各处理秋茬(a)及春茬(b)基质的代谢通路Fig.4 Metabolic pathways of substrates in autumn stubble (a) and spring stubble (b) for each treatment

2.4 茬口、基质以及互作对基质理化性质和基质细菌群落多样性影响

分析基质、茬口和基质×茬口对于基质理化性质和基质细菌群落多样性的影响，结果见表3。可知：相较茬口及基质×茬口，基质的不同处理对于基质理化指标和细菌群落多样性均有显著影响。茬口、基质和茬口×基质均对基质容重、有机质、香农指数、辛普森指数和均匀度指数有显著影响。

表3 茬口、基质处理及两者互作对基质养分和细菌群落多样性的影响
Table 3 Effects of stubble, substrate treatments and their interactions on substrate nutrients and bacterial community diversity

项目Item容重Bulkdensity总孔隙度TotalporositypH电导率EC全氮Totalnitrogen有机质OrganicmatterChao1指数Chao1index辛普森指数Simpsonindex香农指数Shannonindex均匀度指数Pielouindex茬口×基质 P值Stubble×SubstrateP value0.0280.1040.3720.0010.0890.0210.060<0.001<0.001<0.001茬口P值Stubble P value<0.0010.001<0.0010.414<0.0010.0020.063<0.001<0.001<0.001基质P值Substrate P value<0.001<0.001<0.0010.0010.001<0.0010.001<0.001<0.0010.001

注：<0.05代表影响显著；<0.001代表影响极显著；>0.05代表影响不显著。
Note: <0.05 presents significant impact; <0.001 presents very significant impact, and >0.05 stands no significant impact.

2.5 基质环境因子与细菌群落组成和代谢的冗余分析

将细菌主要菌门和细菌代谢功能分别与环境因子进行冗余分析，评估环境因素对基质细菌群落分布的影响，结果表明：6个环境因子对于细菌门水平的群落分布的影响程度为70.83%， 有机质、全氮和总孔隙度是RDA1的主要贡献指标，容重和全氮是RDA2的主要贡献指标。春茬与秋茬离散于RDA2轴上下两侧，说明茬口显著影响了微生物群落分布。

蚯蚓粪、蚯蚓粪+生物炭和草炭、草炭+生物炭分布在受有机质和全氮主导的RDA1轴左右两侧，说明不同基质材料的有机质和全氮对细菌群落分布有显著影响。绿弯菌门(Chloroflexi)与容重和pH呈正相关； EC、总孔隙度与有机质主要影响变形菌门(Proteobacteria)与芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)图5(a)。环境因子与微生物代谢通路的冗余分析表明，RDA1和RDA2分别解释总变异的49.06%和14.09%，pH和容重对细菌主要代谢功能影响较为显著(图5(b))。异生物质的生物降解和代谢(XBM)、脂质代谢(LM)和碳水化合物代谢(CM)与EC与pH呈正相关，容重与除XBM和LM之外的细菌代谢功能呈正相关关系；有机质与除XBM和LM之外的细菌代谢功能呈负相关。

3 讨 论

有机质含量和全氮含量是评价无土栽培基质的重要指标。本研究发现草炭+生物炭、蚯蚓粪+生物炭处理的有机质含量和全氮较草炭、蚯蚓粪均有显著提高：一方面可能是因为生物炭本身富含易被微生物利用的碳源和氮源，为微生物生长和繁育提供了充足养分；另一方面由于生物炭具有较强的吸附作用，可富集更多微生物，微生物具有养分固持和转换氮素形态的功能，从而使得有机质和全氮含量提高。这与赖长鸿等、陈坤等和Suutari 等研究结果一致。在首茬(秋茬)种植时黄瓜的单果质量表现为与生物炭混合的处理显著高于单一基质处理，说明生物炭的引入可以促进基质养分的积累从而提高一定的果实产量。由于微生物对于酸碱性的敏感程度较高，中性pH环境更适宜微生物的生长代谢，生物炭与草炭混合后pH高于草炭。添加生物炭也显著降低了两茬蚯蚓粪的容重，蚯蚓粪与生物炭混合处理的容重约为0.64 g/cm，而蚯蚓粪容重约为0.92 g/cm，已有研究表明栽培基质最适宜容重范围为0.1～0.8 g/cm，说明生物炭添加可以改善蚯蚓粪自身过于紧实的物理结构，更适用于无土栽培。

微生物可以参与基质养分循环、分解与转化，进而改变基质的养分环境。细菌作为基质中最主要的微生物，其群落结构和丰度是反映基质肥力的主要生物指标。本试验对2茬共8组基质样品细菌群落在门水平的分布特征进行分析，发现变形菌门、放线菌门和绿弯菌门为优势菌门，与陈梅春等研究结果一致。本研究通过分析微生物Alpha多样性发现，添加生物炭未对蚯蚓粪基质细菌群落多样性产生显著影响，但显著改善了草炭基质的细菌群落多样性，具体表现为草炭+生物炭处理的群落丰富度、多样性和均匀度指数均高于草炭，这与张梦研究结果一致。相较单一蚯蚓粪处理，蚯蚓粪+生物炭处理变形菌门和放线菌门的相对丰度显著提高，其中变形菌门提高约6.42%，放线菌门提高约28.50%；添加生物炭显著提高了草炭和蚯蚓粪厚壁菌门相对丰度。变形菌门和放线菌门在碳氮循环过程中分别具有营养元素富集和固氮的功能，因此本研究中蚯蚓粪与生物炭混合后全氮显著提高。蚯蚓粪+生物炭和草炭+生物炭处理的厚壁菌门相对丰度较蚯蚓粪和草炭处理提高，原因是厚壁菌门可降解大分子有机物质进而促进有机物质的转化，这也是引入生物炭使得基质养分有所提升的原因之一。对2茬共8组基质样品细菌群落在属水平进行分析发现，两茬黄杆菌属细菌丰度均为最高，黄杆菌属细菌可参与降解基质中难以分解的纤维素、木质素等营养物质，秋茬收获后黄瓜植株及根系残留在基质中，促使该菌繁殖，因此春茬时该菌属相对丰度升高。春茬时，假单胞杆菌属在蚯蚓粪+生物炭、草炭+生物炭处理中的丰度水平显著高于蚯蚓粪和草炭处理，表明添加生物炭可促进假单胞杆菌属细菌累积，且已有研究表明，假单胞杆菌属细菌会提高代谢，促进养分转化，这也可能是添加生物炭显著增加有机质含量的原因之一。

对各处理排名前8的菌门与基质环境因子进行冗余分析发现，除秋茬蚯蚓粪处理外，其余处理的春茬与秋茬离散在以容重和全氮为主要贡献指标的RDA2轴上下两侧，说明容重和全氮水平的差异影响了微生物群落在不同茬口的分布，具体表现为：与秋茬相比，春茬基质的细菌群落中的酸杆菌门、拟杆菌门和变形菌门丰度增加，分别增加45.54%、21.42%和14.60%，这是因为春茬较秋茬全氮和有机质含量增加，为主要细菌的生长提供了充足的氮源和养分；除秋茬草炭+蚯蚓粪处理外，含有蚯蚓粪的各处理和含有草炭的各处理分别分布在受有机质和全氮主导的RDA1轴左右两侧，说明不同基质材料对细菌群落代谢有显著影响，原因可能是蚯蚓粪和草炭自身的养分差异引起基质内理化环境的改变。本研究发现总孔隙度、有机质和全氮是影响细菌群落结构组成的关键因子，这与高洪军等研究结果一致。

4 结 论

本研究主要结论如下：与单一的草炭及蚯蚓粪处理相比，草炭及蚯蚓粪分别与生物炭混合会显著增加秋茬黄瓜的单果质量，草炭+生物炭混合基质pH增加，蚯蚓粪+生物炭混合基质的容重降低，草炭+生物炭处理和蚯蚓粪+生物炭处理全氮和有机质含量均有显著增加；混配生物炭可提高草炭细菌群落多样性、丰富度和均匀度，而对蚯蚓粪无显著影响；相较蚯蚓粪处理，蚯蚓粪+生物炭处理变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度显著增加；在春茬，添加生物炭显著增加了黄杆菌属、德沃西亚属和假单胞菌属的相对丰度。不同的基质对细菌群落代谢功能有显著影响，且基质的不同对养分和细菌群落组成多样性的影响程度大于茬口，两者存在显著互作效应。冗余分析表明，有机质、全氮和容重与细菌群落结构的变化密切相关，不同茬口显著影响细菌群落代谢。综上，将生物炭与草炭和蚯蚓粪分别混合可显著提高基质养分和增加细菌群落丰富度及多样性。