产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离鉴定及其发酵条件优化

马 莉，刘慧燕，方海田*，辛世华，李一鸣，贺捷群

（1.宁夏大学 食品与葡萄酒学院 宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室，宁夏 银川 750021；2.宁夏工商职业技术学院 旅游管理系，宁夏 银川 750021）

浆水主要是将莲花菜、芹菜等蔬菜切条后放入发酵器皿，而后加入煮沸的面汤，待冷却后以旧浆水做引子进行发酵而成。主要分布在我国陕西、甘肃、宁夏等西北地区[1-2]，其气味清香、口感酸爽，可止渴消食、利小便、止呕吐、治泻痢等[3]。近年，研究者发现，浆水的风味和发酵品质与参与发酵的微生物的特性有关[4]。同时，浆水中含有许多功能性乳酸菌株，浆水的许多功能性被认为与乳酸菌及其代谢产物息息相关。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），是由α-谷氨酸（α-aminoglutaric acid，GA）通过谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）催化脱羧生成的非蛋白氨基酸[5]。GABA具有改善睡眠[6]、降血压[7]、防止动脉硬化[8]和改善肝、肾脏功能[9]等多种生理功效。生产GABA的方法有三种[10]，分别为微生物发酵法、化学合成法和植物富集法。微生物发酵法相比于化学合成法和植物富集法，具有操作简单、专一性高且环保等优点[11]。微生物发酵法是将L-谷氨酸（L-glutamic，L-Glu）通过谷氨酸脱羧酶将其转化为GABA。目前，乳酸菌因为其本身较安全且性能优良，已成为微生物法生产GABA的优势菌种[12]。

产GABA的乳酸菌株由于其分离源不同，GABA产量及发酵特性存在很大的差异。肖秋颖等[13]从川西高原传统发酵牦牛乳中分离出发酵乳杆菌84，GABA产量为1.587 g/L；国立东等[14]从东北酸菜中筛选出植物乳杆菌HUCM115，GABA产量为101.3 μg/mL；刘璐等[15]从发酵鱼酱酸中分离出植物乳杆菌Y279，GABA产量为0.209 g/L。PARK S Y等[16]从泡菜中分离出的植物乳杆菌K154，GABA产量为0.170 g/L；SANTOS-ESPINOSA A等[17]从墨西哥干酪中分离出的乳酸乳球菌L-571，GABA产量为（1 153.1±13.5）mg/L。

本研究以宁夏地区传统发酵食品浆水为原料，采用纯培养、薄层层析法及高效液相色谱法分离筛选出具有GABA生产能力的菌株，并对其进行形态学观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，通过耐酸耐胆盐性试验及生长特性分析，筛选出最优菌株，并采用单因素试验及响应面试验对菌株产GABA发酵条件进行优化，以期为生产食品级GABA及下一步应用到果蔬汁的发酵提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

浆水（主要成分莲花菜、芹菜、面汤）：采自宁夏当地农户。

1.1.2 化学试剂

细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；乙腈（色谱纯）：天津市大茂化学试剂厂；γ-氨基丁酸标准品（纯度＞98%）：上海爱解生物科技有限公司；丹磺酰氯（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；酵母粉（生化试剂）、乙酸钠（分析纯）：银川伟博鑫生物科技有限公司；琼脂粉（分析纯）、L-谷氨酸（L-Glu）（纯度＞98%）：上海优宁维生物科技有限公司。

1.1.3 培养基

MRS固体培养基、MRS肉汤培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

含L-Glu的发酵培养基：MRS肉汤培养基中加入2%琼脂粉、1.5%L-谷氨酸。121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

LRH-250生化培养箱：广东省医疗器械厂；WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；安捷伦1260高效液相色谱仪：安捷伦（中国）科技有限公司；BXM-30R 立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司；TGL-16M高速台式冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；C200凝胶电泳成像分析系统：美国Azure Biosystems生物公司；PHSJ-3F pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；Mastercycler X50聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国Eppendorf公司；164-5050电泳仪：美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乳酸菌的分离纯化

将浆水汁稀释至10-3、10-4，均匀涂布于MRS固体培养基，37 ℃静置培养48 h，挑选形态外观良好、具有典型乳酸菌菌落特征的单菌落再次分离纯化，最后采用脱脂乳保藏法保藏用于后续实验。

1.3.2 产GABA乳酸菌的定性和定量分析

（1）薄层层析法定性测定GABA

将预先保藏好的菌株接种到MRS液体培养基连续活化两代，以4%的接种量接种到含L-Glu的发酵培养基，37 ℃培养48 h，从离心后的培养液取上清液，利用薄层层析法[18]定性测定GABA，展开剂为正丁醇、冰醋酸、水（4∶3∶1，V/V），以0.6%的茚三酮溶液作为显色剂，以0.1%的GABA标准品作为对照，进行薄层层析，层析完毕干燥后喷显色剂进行显色，比较比移值（Rf值）。若样品与GABA标准品出现相同的Rf值，说明样品中有GABA产生。

（2）高效液相色谱法定量测定GABA

将利用薄层层析法定性后具有产GABA能力的菌株采用高效液相色谱法[19-20]测定GABA产量。衍生化反应：取发酵液样品/GABA标品200μL，加入200μLNaHCO3-Na2CO3缓冲液（pH=11.2）和400 μL 9 g/L的丹磺酰氯溶液，充分振荡5 s，30 ℃反应30 min，过0.45 μm滤膜。

高效液相色谱条件：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.025mol/L乙酸钠，用4%的乙酸调pH至6.2±0.05，流动相B为乙腈，流速为1.0 mL/min；梯度洗脱表见表1，柱温40 ℃，进样量20 μL，检测波长386 nm。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.3.3 产GABA菌株的鉴定

（1）形态学特征和生理生化鉴定

形态学观察：根据《伯杰细菌鉴定手册》[21]中对乳酸菌进行菌落及细胞形态观察。

生理生化试验：参考《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[22]和《伯杰细菌鉴定手册》，对初筛的优良菌株进行明胶液化、过氧化氢酶、硝酸还原、淀粉水解、硫化氢（H2S）、糖发酵等生理生化特性试验。

（2）16S rDNA分子生物学鉴定

DNA的提取使用细菌基因组DNA 提取试剂盒，通用引物为：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。PCR扩增体系（25 μL）[23]：PremixTaq酶12.5 μL，正反向引物各1 μL，模板DNA 1 μL，双蒸水（ddH2O）9.5 μL。PCR扩增条件[24]：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性30 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行30个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR 扩增产物进行电泳后，用凝胶成像仪进行观察，将有效PCR扩增产物在低温下送至生工（上海）股份有限公司进行测序。测序后的16S rDNA基因序列提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Gen-Bank数据库中，采用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源搜索比对，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA7.0软件中的邻接（neighbor joining，NJ）法构建系统发育树。

1.3.4 筛选菌株耐受性及生长特性

（1）耐酸性试验

益生菌在进入人体肠道的过程中需要耐受胃部的酸性环境[25]，只有当活菌进入胃肠道后，益生功能才能发挥出来。所以，耐酸性是衡量乳酸菌优良特性的重要指标。将MRS液体培养基初始pH值调至2.5，在此条件下将试验菌在37 ℃下进行恒温培养，分别将0 h和3 h的培养液进行活菌平板计数。

（2）耐胆盐试验

以MRS为基础培养基，添加0.3%的猪胆盐[26]，将试验菌37 ℃恒温培养，分别将0 h和3 h的培养液进行活菌平板计数。

（3）生长曲线及产酸曲线

将连续活化两代后的菌株在37 ℃培养，每隔4 h取样，测定其OD600nm值及pH值的变化，绘制菌株生长曲线及产酸曲线。

1.3.5 存活率计算公式

式中：N1表示培养3 h 测定的活菌数对数，lg（CFU/mL）；N0表示培养0 h 测定的活菌数对数，lg（CFU/mL）。

1.3.6 发酵条件的优化

（1）单因素试验

以发酵液初始pH值为5.0、发酵温度为37 ℃、培养时间为48 h为初始试验条件，在此基础上分别考察初始pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、发酵温度（31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃）、发酵时间（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）对GABA产量的影响。

（2）响应面试验

在单因素试验结果基础上，以初始pH值（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为自变量，以GABA产量（Y）为响应值，采用响应面试验优化发酵条件，响应面试验因素与水平见表2。

表2 发酵条件优化响应面试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments design for fermentation conditions optimization

2 结果与分析

2.1 产GABA菌株的定性、定量测定结果

本实验共分离出21株乳酸菌株（分别编号1～11，①～⑩），采用薄层层析法定性检测结果见图1。

图1 筛选菌株发酵液薄层层析色谱图Fig.1 Thin layer chromatography of fermentation broth of screened strain

由图1可知，21株乳酸菌中有6株菌（编号为2、6、7、③、⑦、⑧）与GABA标准品有相同的Rf值，其中菌株2颜色最深，说明其GABA产量最高。采用高效液相色谱法对6株分离菌发酵液中GABA含量进行测定，结果见图2。

图2 筛选菌株发酵液中γ-氨基丁酸含量HPLC测定结果Fig.2 Determination results of γ-aminobutyric acid contents in fermentation broth of screened strain by HPLC

由图2可知，6株分离菌株产GABA的能力存在一定差异，其中分离菌株2、⑧发酵液中GABA产量相对较高，而其他分离菌发酵液中产量较低。根据其他学者的研究，刘晓飞等[27]从寒土地中筛选出的5株乳酸菌，GABA产量最低为0.56 g/L，最高为0.81g/L；田蕊等[28]从酸马奶中分离出的17株乳酸菌的GABA产量为0.015～0.731 g/L；王兴洁等[29]从四川泡菜中筛选出的4株乳酸菌的GABA产量为1.54～2.18 g/L。分析发现，从同一种分离源中筛选出来的乳酸菌GABA产量有所不同，与本研究的结果一致。结果表明，菌株2产GABA能力最强，其GABA产量为0.22 g/L。

2.2 产GABA菌株的生理生化及其分子生物学鉴定结果

2.2.1 筛选菌株形态学观察

6株筛选菌株形态学观察结果见图3。由图3a可知，6株分离菌菌落呈现白色圆形状，表面干净，中间凸起，具有微微的酸味；由图3b可知，经革兰氏染色后显现紫色，说明为革兰氏阳性菌，在显微镜下观察呈杆状。

图3 6株筛选菌株的菌落（a）及细胞（b）形态Fig.3 Colony (a) and cell (b) morphology of 6 screened strains

2.2.2 筛选菌株生理生化试验

6株筛选菌株生理生化试验结果见表3。由表3可知，糖发酵实验中菌株2、6、7、③、⑦、⑧不能利用鼠李糖、乳糖，结果呈阴性，其他实验结果均呈阳性。6株分离菌的明胶液化、淀粉水解、过氧化氢酶等实验结果均呈阴性，根据《伯杰细菌鉴定手册》[21]可初步判定这6株菌为乳杆菌属。

表3 6株筛选菌株生理生化试验结果Table 3 Results of physiological and biochemical tests of 6 screened strains

2.2.3 分子生物学鉴定结果

6 株筛选菌株16S rDNA基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图见图4。由图4可知，在1 500 bp左右有明显的条带出现。测序后，将测序结果提交至GenBank数据库进行BLAST比对，选取同源性较高的模式菌株的16SrDNA序列，用MEGA 7.0软件构建系统发育树，结果见图5。由图5可知，菌株2、6、7、③、⑦与植物乳杆菌同源性最高，均被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株⑧与发酵乳杆菌同源性最高，被鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium）。

图4 6株筛选菌株16S rDNA序列的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of 16S rDNA of 6 screened strains

图5 基于16S rDNA基因序列6株筛选菌株的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of 6 screened strains based on 16S rDNA gene sequence

2.3 菌株的耐受性实验结果

耐受能力是益生菌的重要特性之一。将筛选的6株菌株进行耐受性实验，结果见图6。由图6a可知，当胆盐含量为0.3%，培养3 h后6株菌的存活率均＞88%，且活菌数符合乳酸菌发挥作用的最低值，说明这6株菌胆盐耐受性良好，其中菌株2胆盐耐受性最好。在相同胆盐含量下，王祎然等[30]从酸汤中筛选出的6株乳酸菌培养3 h后存活率均＞88%；胡斌等[31]对8株菌培养2 h后存活率为24.1%～91.1%；李洋等[32]对6株菌培养3 h后存活率为5.37%～41.64%。可以看出，本实验6株菌对胆盐的耐受能力更好。由图6b可知，在pH为2.5的酸性条件下培养3 h后，6株菌存活率均＞86%，活菌数达到了107CFU/mL，说明这6株菌均具有良好的耐酸性，其中菌株2耐酸性最好。云月英等[33]对4株乳酸菌在pH值为3时培养3 h，存活率为5.4%～80%；王帅静等[34]对7株菌在pH为2和3时培养时几乎不生长。可见本实验6株菌对酸的耐受能力更强。

图6 6株筛选菌株的胆盐（a）及酸（b）耐受性Fig.6 Tolerance of bile salt (a) and acid (b) of 6 screened stains

2.4 菌株2的生长及产酸曲线

将产GABA能力最强的菌株2进行生长及产酸曲线测定，结果见图7。由图7可知，菌株2在4 h后生长速率加快，呈指数增长，在16 h后趋于稳定。同时，能否快速产酸也标志着乳酸菌活力是否良好。由图7可知，菌株2在16 h内快速产酸，因此说明该菌具有良好的生长和产酸能力。

图7 菌株2的生长曲线及产酸曲线Fig.7 Growth and acid production curves of strain 2

2.5 发酵条件优化单因素试验结果

将产GABA能力最强的菌株2发酵条件进行单因素试验优化，结果见图8。适宜的pH值对菌株的生长有很大的促进作用，pH值也是控制酶活的重要因素，有相关研究表明[35]，谷氨酸脱羧酶（GAD）的活性在pH值为4～6时表现最佳，pH值升高会导致脱羧作用减弱，从而使GABA分解加快。

图8 初始pH值（a）、发酵温度（b）和发酵时间（c）对γ-氨基丁酸产量的影响Fig.8 Effect of initial pH (a),fermentation temperature (b) and time (c) on γ-aminobutyric acid yield

由图8a可知，当初始pH值为4.5～5.5时，发酵液中GABA产量随初始pH值增加而升高；当初始pH值为5.5时，发酵液中GABA产量最高，为0.55 g/L；当初始pH值＞5.5之后，发酵液中GABA产量有所下降。因此，选择最适发酵初始pH值为5.5。适宜的温度是微生物生长和代谢的前提。由图8b可知，当发酵温度为31～35 ℃时，发酵液中GABA产量随温度增加而升高；当发酵温度为35 ℃时，发酵液中GABA含量达到峰值为0.59 g/L；当发酵温度＞35 ℃之后，发酵液中GABA产量有所下降。因此，选择最适发酵温度为35 ℃。由图8c可知，当发酵时间为24～60 h时，发酵液中GABA随发酵时间增加而升高；当发酵时间到达60 h时，发酵液中GABA产量达到最高，为0.62 g/L；当发酵时间＞60 h之后，随着时间的增加GABA产量无明显变化，可能是因为发酵液中底物已经完全分解。因此，选择最适发酵时间为60 h。

2.6 发酵条件优化响应面试验分析

在单因素试验基础上，以初始pH值（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为自变量，以GABA产量（Y）为响应值，采用响应面试验优化发酵条件，响应面试验设计及结果见表4。

表4 发酵条件优化响应面试验设计及结果Table 4 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization

以GABA产量为（Y）为响应值，以发酵液初始pH值（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为自变量建立回归方程如下：

由表5可知，该模型P值＜0.000 1，表明该回归模型中每项对结果的影响极显著，失拟项P值=0.296 0＞0.05，表明该回归模型拟合度良好，具有一定的可信度。回归方程的决定系数R2为0.986 5，校正决定系数R2adj为0.969 2。由P值可知，该模型一次项B、交互项BC和二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），其他项的对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，3个因素对GABA产量的影响强弱顺序为：发酵温度＞发酵时间＞初始pH值。

表5 回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

各因素间交互作用对GABA产量影响的响应面及等高线见图9。由图9可知，GABA产量随着各因素数值的不断增加呈先增高后降低的趋势，说明各因素之间具有一定的交互作用。其中BC曲面弯曲程度最大，等高线呈现椭圆状，说明BC交互作用及极显著（P＜0.01），而AB和AC等高线更偏向圆形，说明其交互作用不显著，表明交互作用对GABA产量影响相对较小。该结果与方差分析结果一致。

图9 初始pH值、发酵温度和发酵时间间交互作用对γ-氨基丁酸产量影响的响应面和等高线Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial pH,fermentation temperature and time on γ-aminobutyric acid yield

通过响应面软件对方程求解，得到最佳发酵条件为：发酵液初始pH值5.78、发酵温度36 ℃、发酵时间63.03 h，在此条件下，GABA产量理论值为0.788 7 g/L。为了验证模型的可靠性，同时考虑到操作及成本问题，将上述发酵条件修正为：发酵液初始pH值5.8、发酵温度36 ℃，发酵时间60 h。在此优化条件下，GABA 产量实际值为0.778 g/L，与理论值相接近，表明该方案可行。

3 结论

本研究从宁夏当地浆水中分离出21株菌株，利用薄层层析法、高效液相色谱法筛选出6株具有产GABA能力的菌株，经形态学观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，确定5株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），1株为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium）。将GABA产量最高的植物乳杆菌2为试验菌株，其优化发酵条件为初始pH值5.8，发酵温度36 ℃，发酵时间60 h。在此优化条件下，GABA的产量为0.778 g/L，比优化之前产量提高了3.5倍，为生产食品级GABA及下一步应用到果蔬汁的发酵提供研究基础。