高糖化力米根霉G1培养条件优化

唐 洁，杨 强，刘源才，江 威，夏金阳，陈申习

（劲牌有限公司 劲牌研究院 中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 大冶 435100）

米根霉（Rhizopus oryzae）在分类学上属于真核生物界的接合菌门、接合菌纲、毛霉目、毛霉科中的根霉属，是自然界中广泛存在的一类真菌，并经过美国食品药品监督管理局认证的安全菌株[1]。R.oryzae能够利用不同的化合物和多糖作为能源和碳源，产生许多代谢产物，主要有酶类、酯类、有机酸、风味物质、聚合物和生物乙醇等，其代谢产物如乳酸、富马酸、L-苹果酸及消化酶等有重要的经济价值，可广泛用于食品、医药及饲料等行业[2]。R.oryzae优势驱动力是其产生的淀粉酶和糖化酶可以将淀粉分解为葡萄糖，并产生乳酸和高级醇等风味物质，在酿酒发酵初期起关键作用[3]。小曲清香型白酒中R.oryzae在发酵初期占主导，主要起糖化作用，将淀粉水解为其他菌株可利用的糖类物质[4]。

微生物菌株的高产特性除其遗传特性决定外，其所处环境条件对其生长以及代谢途径也有很大的影响。由于R.oryzae含有丰富的糖化型淀粉酶，因此对碳源的利用较广。但R.oryzae缺乏酸性蛋白酶，对氮源要求比较严格，偏好有机氮源，而一旦缺乏有机氮，则会影响菌丝的生长和产酶酶活或导致菌种退化[1]。GHOSH B等[5]考察了不同氮源对根霉菌株产异淀粉酶的影响，发现蛋白胨和尿素促进了该酶的产量。此外，R.oryzae需要大量的其他微量元素来进行生长代谢。GHOSH B等[6]研究发现，Mn2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+和Ca2+能促进R.oryzaePR7异淀粉酶酶活力的增加。FUJIO Y等[7]研究发现，在霉菌基础液体培养基中添加Zn2+和Ca2+有利于R.oryzae糖化酶酶活的提高。刘延波等[8]从大曲中分离筛选得到1株耐高温根霉菌，通过单因素试验测定其糖化酶活力，结合响应面分析法优化其培养条件，测得其糖化酶活力在料水比为5∶3（g∶mL）、氮源添加量为0.4%、培养时间为5 d时最高，经试验验证酶活力达到162.38 U/g，与预测值基本接近。

实际生产中，根霉麸曲的制作流程为：根霉一级种（试管种）→根霉二级种（液态培养）→根霉麸曲。随着R.oryzae传代次数的增加、漫长的生产周期和复杂的培养成分往往会产生有害物质，导致R.oryzae较易出现退化现象[3]。为降低生产成本及提高生产效率，R.oryzae培养基的营养成分、培养温度等因素对其是否能发挥最大的产酶生理活性、生产出优质高产的酒曲起着至关重要的作用。而文献报道更多的是对根霉麸曲制作条件[13-16]及R.oryzae单菌株产酶活性条件的优化[9-12]，很少对制作根霉麸曲的种子生长及糖化性能进行系统研究，且同种属不同株的R.oryzae生长及最佳糖化性能的培养条件不同。因此，优化发酵条件和培养基成分，创造适合菌体生长和代谢的最佳条件以充分发挥菌种的潜力，是提高R.oryzae糖化性能的关键。否则即使有了优良菌株，菌种的生产能力也不能充分体现。因此，本研究通过单因素、正交试验对R.oryzaeG1培养条件进行优化，以充分发挥菌株的糖化性能，进一步提高菌株的发酵性能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米根霉（Rhizopus oryzae）G1：劲牌公司酒曲中分离并应用于小曲清香型白酒生产中。

早籼米、琼脂、马铃薯、大麦芽、麸皮：市售；葡萄糖、乳糖、海藻糖、低聚果糖、蔗糖、淀粉、牛肉浸膏、酵母浸粉、蛋白胨、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、柠檬酸铵、NaNO3、ZnSO4、KCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、孟加拉红培养基等均为分析纯或生化试剂：国药集团化学试剂有限公司。

霉菌完全合成培养基[17]：蔗糖100 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO43 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，KH2PO42 g/L，琼脂粉20 g/L；高粱汁琼脂培养基、酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基、麸皮培养基：按参考文献[18]方法配制；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、麸皮汁琼脂培养基：按参考文献[19]方法配制。

米曲汁琼脂培养基[20]：以种曲∶水=1∶4补足水，加入适量的糖化酶，55 ℃糖化24 h，过滤，滤液糖度降至5°Bx，pH调到6.0，加入20%琼脂粉。

麦芽汁琼脂培养基：取适量麦芽浸粉加水溶解，使糖度达10°Bx，加入20%琼脂粉。

以上培养基均121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

FE20 pH计、AL204电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BCM-1600A洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；BSC-150 恒温恒湿培养箱、YXQ-LS-75-SII立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SFG-02B电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备仪器厂；HYCD-205冷藏冷冻箱：青岛海尔特种电器有限公司；WFJ2000 可见光光度计：尤尼科（上海）仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1R.oryzaeG1培养条件优化单因素试验

培养基种类对R.oryzaeG1糖化能力的影响：将R.oryzaeG1分别接种至米曲汁琼脂、高粱汁琼脂、麦芽汁琼脂、麸皮汁琼脂、PDA、YPD琼脂、孟加拉红培养基中培养，并以霉菌完全合成培养基为对照，培养3 d后将菌丝体接种至麸皮培养基制备成麸曲，并测其糖化力和糖化酶酶活。

氮源对R.oryzaeG1糖化能力的影响：以1.3.1确定的最佳培养基为基础，分别添加3 g/L的酵母浸粉、蛋白胨、牛肉浸膏、（NH4）2SO4、柠檬酸铵、（NH4）2HPO4、NaNO3，并以不添加氮源的培养基为对照，培养3 d后将菌丝体接种至麸皮培养基制备成麸曲，测其糖化力和糖化酶酶活，考察对R.oryzaeG1糖化性能的影响，筛选出最优氮源。确定最优氮源后，分别向培养基中添加1 g/L、3 g/L、6 g/L、9 g/L、12 g/L和15 g/L的最优氮源，考察氮源添加量对R.oryzaeG1糖化性能的影响。

碳源对R.oryzaeG1糖化能力的影响：以1.3.1确定的最佳培养基为基础，分别添加20 g/L的淀粉、低聚果糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、甘油，并以不添加碳源的培养基为对照，培养3 d后将菌丝体接种至麸皮培养基制备成麸曲，测其糖化力和糖化酶酶活，考察对R.oryzaeG1糖化性能的影响，筛选出最优碳源。确定最优碳源后，分别向培养基中添加15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L和40 g/L的最优碳源，考察碳源添加量对R.oryzaeG1糖化性能的影响。

无机盐对R.oryzaeG1糖化能力的影响：以1.3.1确定的最佳培养基为基础，分别添加0.5 g/L的KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、ZnSO4，并以不添加无机盐的培养基为对照，培养3 d后将菌丝体接种至麸皮培养基制备成麸曲，测其糖化力和糖化酶酶活，考察对R.oryzaeG1糖化性能的影响，筛选出最优无机盐。分别向确定的培养基中添加0.1 g/L、0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L和2.5 g/L的最优无机盐，优化无机盐添加量。

培养温度对R.oryzaeG1糖化能力的影响：将R.oryzaeG1接种至1.3.1确定的最佳培养基中，参考文献[13]选取了不同培养温度（25 ℃、30 ℃、33 ℃、37 ℃）进行培养，培养3 d后将菌丝体接种至麸皮培养基制备成麸曲，测其糖化力及糖化酶酶活。

1.3.2R.oryzaeG1一级种培养条件优化正交试验

根据单因素试验结果，以蛋白胨添加量、葡萄糖添加量、CaCl2添加量和培养温度为4个因素，各因素设计3水平，采用L9（34）正交试验，以糖化力为评价指标，确定R.oryzaeG1一级种产糖化力最佳培养条件。正交试验因素与水平如表1所示。

表1 米根霉G1培养条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for culture conditions optimization of Rhizopus oryzae G1

1.3.3 测定方法

糖化力：采用化饭法[20]。糖化力定义为每1 g麸曲糖化100 g大米饭24 h所生成的葡萄糖的质量（g），单位为g/100 g。

糖化酶酶活：采用3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[21]。酶活定义为1 g绝干麸曲在35 ℃、pH4.6条件下1 h内分解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位，U/g。

1.3.4 数据处理

采用Origin2018进行绘图，正交试验助手设计正交试验和SPSS 19.0对正交试验结果进行方差分析，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 培养条件优化单因素试验

2.1.1 培养基种类对R.oryzaeG1产酶及糖化力的影响

由图1可知，麸皮汁琼脂培养基培养的R.oryzaeG1糖化力最高，为30.73 g/100 g，其次是米曲汁琼脂和PDA培养基培养的；高粱汁琼脂培养基培养的R.oryzaeG1糖化酶酶活最高，其次是麸皮汁、米曲汁和麦芽汁琼脂培养基，最低的为孟加拉红培养基培养的R.oryzaeG1。文献报道，长期单一使用某种培养基易使菌株发生退化[22-24]。本研究考察了不同培养基培养R.oryzaeG1生长及生产特性，这为R.oryzaeG1长期培养防止退化提供了试验数据和参考。因此，选择麸皮汁琼脂培养基作为R.oryzaeG1生长及糖化性能最佳培养基备选。

图1 不同种类培养基对米根霉G1产酶及糖化力的影响Fig.1 Effect of different media on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

2.1.2 氮源对R.oryzaeG1产酶及糖化力的影响

氮源是微生物生长繁殖必需的营养物质，不同氮源培养R.oryzaeG1生长情况不同。文献报道，相比无机氮源，R.oryzae更喜欢利用有机氮源[2]。由图2可知，添加蛋白胨为氮源培养的R.oryzaeG1糖化力最高，为31 g/100 g，其次是添加牛肉浸膏、酵母浸粉为氮源；且添加有机氮源培养的R.oryzaeG1糖化力明显高于无机氮源。添加酵母浸粉为氮源培养的R.oryzaeG1糖化酶酶活最高，添加柠檬酸铵为氮源培养的R.oryzaeG1糖化酶酶活最低，而添加其他氮源培养的该菌株糖化酶酶活相差不大。因此选择R.oryzaeG1产酶的最佳添加氮源为蛋白胨。

图2 氮源种类对米根霉G1产酶及糖化力的影响Fig.2 Effect of nitrogen source type on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

在确定R.oryzaeG1产酶的最佳添加氮源为蛋白胨的基础上，进一步优化氮源添加量。由图3可知，当蛋白胨添加量为3 g/L时，糖化力和糖化酶酶活均最高，随后糖化力和酶活均下降，这可能与培养基中碳氮比有关，在一定的范围内菌株才能发挥最佳的性能。因此，选择R.oryzaeG1产酶最佳蛋白胨添加量为3 g/L。

图3 蛋白胨添加量对米根霉G1产酶及糖化力的影响Fig.3 Effect of peptone addition on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

2.1.3 碳源对R.oryzaeG1产酶及糖化力的影响

一般来说，R.oryzae主要以葡萄糖为碳源，但其可以使用不同糖类用于生长，如纤维二糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、核糖和木糖等。GHOSH B等[25]评估了不同碳源对R.oryzaePR7MTCC9642异淀粉酶产生的影响，发现这种微生物可以使用淀粉和糖原来产酶。添加乳糖和甘油培养菌丝R.oryzaeG1生长情况一般，其余菌丝均生长旺盛。由图4可知，添加葡萄糖为碳源培养的R.oryzaeG1糖化力最高，为31.67 g/100 g，添加乳糖为碳源的糖化力最低；添加海藻糖、蔗糖和乳糖为碳源培养的菌丝制备麸曲糖化酶酶活比较低，添加其他碳源培养酶活较高且相差不大。文献报道，糖化能力取决于糖化酶活性的表达，而糖化酶相关基因的表达受各种碳源的影响，导致糖化能力的差异[3]。因此，选择R.oryzaeG1产酶的最佳添加碳源为葡萄糖。

图4 碳源种类对米根霉G1产酶及糖化力的影响Fig.4 Effect of carbon source type on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

在确定R.oryzaeG1产酶的最佳添加碳源为葡萄糖的基础上，进一步优化碳源添加量。由图5可知，当葡萄糖添加量为20 g/L时，糖化力和糖化酶酶活均最高，随后糖化力和酶活均下降。葡萄糖添加过高会加大培养基的渗透压，不利于菌体的生长，从而影响菌株的性能。因此，选择R.oryzaeG1产酶最佳葡萄糖添加量为20 g/L。

图5 碳源添加量对米根霉G1产酶及糖化力的影响Fig.5 Effect of carbon source addition on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

2.1.4 无机盐对R.oryzaeG1产酶及糖化力的影响

R.oryzae需要其他微量元素来进行生长代谢和产酶，无机盐与酶的激活等作用息息相关。本试验选取了根据文献报道[6-7]有利于R.oryzae糖化酶酶活提高的Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+以及调节渗透压的K+。由图6可知，与对照不添加无机盐相比，添加MgSO4·7H2O、ZnSO4对R.oryzaeG1产糖化力没有提升反而有所抑制。添加FeSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4对产糖化力有促进作用，尤以添加CaCl2促进R.oryzaeG1糖化性能的提升，糖化力和糖化酶酶活均最高。因此，选择R.oryzaeG1产酶的最佳添加无机盐为CaCl2。

图6 无机盐种类对米根霉G1产酶及糖化力的影响Fig.6 Effect of inorganic salt type on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

在确定R.oryzaeG1产酶的最佳添加无机盐为CaCl2的基础上，进一步优化无机盐添加量。当CaCl2添加量为1.5 g/L时，R.oryzaeG1产糖化力和糖化酶酶活最高。CaCl2作为无机盐可以提供与酶活力相关的Ca2+，从而促进菌体的代谢产酶。因此，选择R.oryzaeG1产酶最佳CaCl2添加量为1.5 g/L。

图7 无机盐添加量对米根霉G1产酶及糖化力的影响Fig.7 Effect of inorganic salt addition on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

2.1.5 培养温度对R.oryzaeG1产酶及糖化力的影响

R.oryzae在合适的培养温度条件下生长时间短且菌丝体生长良好[26]，且温度是影响微生物产酶的重要因素之一[27]，因此考察了不同培养温度对R.oryzaeG1生长的影响，不同培养温度培养3 d后菌丝生长情况见图8。由图8可知，气生菌丝茂密程度为25 ℃＞30 ℃＞33 ℃＞37 ℃，表明此菌株随着培养温度的升高，对气生菌丝的繁殖有一定的抑制。尤其当培养温度达37 ℃时，R.oryzaeG1菌丝偏黄、孢子量较少。其余培养温度培养下的根霉G1菌丝白色，且孢子量较多。

图8 不同培养温度条件下米根霉G1生长情况Fig.8 Growth status of Rhizopus oryzae G1 at different culture temperature conditions

由表2可知，R.oryzaeG1在37 ℃和25 ℃条件下培养时糖化力最高，均达到30 g/100 g；30 ℃和33 ℃条件下培养的糖化力相对较低。结合菌丝生长情况，选择R.oryzaeG1产酶最佳培养温度为25 ℃。

表2 不同培养温度条件下培养的米根霉G1糖化力及糖化酶酶活Table 2 Saccharification ability and saccharification enzyme activity of Rhizopus oryzae G1 cultured at different temperature conditions

2.2 培养条件优化正交试验

由表3可知，各因素对R.oryzaeG1糖化力影响程度依次为（A）蛋白胨添加量＞（B）葡萄糖添加量＞（D）培养温度＞（C）CaCl2添加量。由直观分析可以看出，R.oryzaeG1糖化能力最佳培养条件为A2B3C3D2，即在麸皮汁琼脂培养基基础上添加3 g/L蛋白胨、30 g/L葡萄糖、2.5 g/L CaCl2，培养温度为30 ℃。由表4可知，主体间效应的检验中校正模型的P＜0.01代表该模型具有极其显著的统计学意义，且蛋白胨添加量、葡萄糖添加量和培养温度对糖化力具有极显著影响（P＜0.01），为主要因素，无机盐添加量对糖化力具有显著影响（P＜0.05），为次要因素[28]。

表3 米根霉G1糖化能力培养条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for culture conditions optimization of Rhizopus oryzae G1

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal tests results

2.3 验证试验

正交试验直接得出的是试验组6（在麸皮汁琼脂培养基上添加3 g/L蛋白胨、30 g/L葡萄糖和0.5 g/L CaCl2，培养温度为30 ℃）糖化力最高，因此将此结果与方差分析的结果进行验证对比，并以实际生产上常用的米曲汁琼脂培养基为对照，进一步确定培养R.oryzaeG1一级种最佳糖化性能的培养条件，结果见表5。由表5可知，组合2#培养的菌体制备的麸曲糖化力和糖化酶酶活均高于组合1#和对照培养的菌体制备的麸曲，优化后糖化力达到33.97 g/100 g。因此，确定了R.oryzaeG1一级种（试管或平皿培养）最佳的培养条件为在麸皮汁琼脂培养基的基础上添加3 g/L蛋白胨、30 g/L葡萄糖和2.5 g/L CaCl2，培养温度为30 ℃。

表5 米根霉G1一级种最佳培养条件的确定Table 5 Determination of optimum culture conditions for first degree species of Rhizopus oryzae G1

3 结论

糖化能力是R.oryzaeG1最重要的功能之一，但在实际生产中此菌株较易出现退化现象，主要表现为生产的麸皮曲糖化力的下降导致了酒曲糖化性能降低，从而使酒曲质量不合格。根霉麸曲是由R.oryzae一级种、二级种逐渐扩大培养而成，R.oryzaeG1一级种作为根霉麸曲的最原始种子，对其糖化性能的提升是提高根霉麸曲糖化力的关键。本研究首先通过单因素试验分别对R.oryzaeG1一级种培养条件进行优化，再通过正交试验和验证试验确定了此菌株一级种处于最佳糖化性能的培养条件。结果表明，氮源添加量、碳源添加量和培养温度对糖化力具有极显著影响（P＜0.01），为主要因素，无机盐添加量对糖化力具有显著影响（P＜0.05），为次要因素。R.oryzaeG1一级种最佳培养条件为在麸皮汁琼脂培养基的基础上添加3 g/L蛋白胨、30 g/L葡萄糖和2.5 g/L CaCl2，培养温度为30 ℃，在此条件下制备的麸曲糖化力为33.97 g/100 g，糖化酶酶活为5 536.64 U/g。本研究为维持R.oryzaeG1一级种高效的糖化性能、防止菌种退化提供了数据参考。下一步将优化好的参数应用于生产提高纯种根霉麸曲糖化能力，进而提升酒曲质量。