红葡萄酒中氨基甲酸乙酯检测方法的优化

马延琴，许尤尤，叶丕平，王 斌，史学伟

（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一种在葡萄酒酿造过程中微生物的代谢副产物，也是酒精发酵饮料中比较常见的有毒污染物，可造成肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病[1]。2007年世界卫生组织国际癌症机构将氨基甲酸乙酯归为2A类致癌物质[2-4]。1985年，加拿大首次规定了葡萄酒、白兰地和威士忌中的EC的限量值[5]。EC在葡萄酒基质中以痕量的形式存在，葡萄酒化学组分复杂，EC检测干扰较大，开发葡萄酒中氨基甲酸乙酯高灵活度检测方法势在必行。

在此之前，气相色谱法（gas chromatography，GC）[6-9]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10-14]、气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[15-19]以及高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[20-21]等是测定EC的主要方法。早在2002年就有研究HPLC方法检测氨基甲酸乙酯的报道，通过柱前衍生化和荧光检测进行了葡萄酒中EC的检测[22]，其中高效液相色谱-荧光法（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）具有灵敏度高、重复性好、应用范围广泛，而且解决了葡萄酒样品处理过程中效率低和复杂的弊端。

薛锡佳等[23]对比了液相色谱串联质谱法与固相萃取法检测白酒中的EC含量的差异，研究表明液相色谱串联质谱法具有样品前处理简单，操作成本低等特点，但重现性低于高效液相色谱法。项东方[24]探讨了酒中氨基甲酸乙酯的检测方法，气相色谱-质谱法虽能避免物质干扰，但存在处理时间长的缺点。陈达玮等[25]采用HPLC对葡萄酒中EC含量进行了研究，结果表明，采用高效液相色谱-荧光法（HPLC-FLD）测定酒中EC时，具有简便快速，成本较低等特点，比较适合在企业中推广使用。该研究根据葡萄酒中EC浓度含量不尽相同的特点，拟结合固相萃取后衍生化反应，采用高效液相色谱-荧光法（HPLC-FLD）测定葡萄酒中EC的含量，通过对葡萄酒进行固相萃取前处理，达到减少不必要的干扰、降低污染色谱系统的概率和提高灵敏度检测的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霞珠葡萄酒；新疆张裕巴堡男酒庄；甲醇（纯度≥99.9%）、乙腈（纯度≥99.9%）（色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；氨基甲酸乙酯（纯度99%）、9-羟基吨（纯度97%）、乙酸钠、甲苯、乙酸乙酯（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；正己烷、乙醚（均为分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；试验使用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100系列高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；NDK200-1氮吹仪：杭州米欧仪器有限公司；KQ-100DE型数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；SOP电子天平（精确到0.000 1 g）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试剂的配制

衍生试剂储备液：准确称取9-羟基吨0.198 0 g于50 mL容量瓶中，甲醇溶解至刻度，配制成0.02 mol/L的储备液，放进冰箱-4 ℃下进行保存。

EC标准储备液：准确称取EC 0.1 mg于100 mL容量瓶，甲醇进行溶解至刻度，配制成1 mg/L的标准储备液，放进冰箱-20 ℃进行保存。

1.3.2 试样净化浓缩[26]

准确量取葡萄酒样品2 mL，加到萃取柱上，静置并吸附10 min，用正己烷（10 mL）进行淋洗，并挤干小柱。然后用10 mL乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）洗脱，汇集洗脱液到10 mL的具塞刻度试管中，在室温下用氮吹仪将洗脱液进行浓缩，最后用甲醇定容至1 mL，经过0.45 μm的微孔滤膜进行过滤，得到的滤液可直接进液相色谱仪进行测定。

1.3.3 液相色谱的检测条件

样品衍生：准确吸取100 μL 9-羟基吨衍生储备试剂于棕色进样瓶中（1.5 mL），吸取500 μL经过浓缩后的滤液，然后吸取50 μL的盐酸溶液（1.5 mol/L），振荡均匀后，放置暗处反应5 min，然后进样分析。

样品检测：液相色谱检测条件的设置参考陈达炜等[27]的方法。C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：乙酸钠溶液（0.02 mol/L，pH 7.2）；流动相B：色谱级乙腈；检测器为荧光检测器，其中入射光波长设置为233 nm，发射光波长设置为600 nm，进样量设置为20 μL，柱温为30 ℃。氨基甲酸乙酯分析梯度洗脱条件见表1。

表1 氨基甲酸乙酯分析洗脱程序Table 1 Elution procedure of ethyl carbamate analysis

1.3.4 样品前处理条件和检测反应时间的优化[28]

采用固相萃取葡萄酒中的EC时，影响EC提取的因素主要包括：吸附时间、淋洗溶剂的种类以及洗脱溶剂的种类和比例。本试验通过向葡萄酒样品中添加EC（100 μg/L），根据回收率来确定样品的最佳前处理条件。

（1）吸附时间的优化

通过向固相萃取柱上样后，设置静置吸附时间为4 min、6 min、8 min、10 min、12 min时，通过回收率平均值以及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分析，确定最佳吸附时间。

（2）淋洗溶剂的选择

在葡萄酒样品经过吸附后，采用溶剂极性较弱的试剂进行淋洗，有效去除葡萄酒中的杂质如颜色、糖分等，而待分析物质EC在固相萃取柱上仍然保留。在此次实验中使用弱极性试剂正己烷、乙酸乙酯及甲苯，通过比较回收率平均值和RSD确定最合适的淋洗溶剂。

（3）洗脱溶剂的优化

根据EC的特性，选取乙酸乙酯、乙醚、乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）3种溶剂作为洗脱溶剂，研究洗脱溶剂种类对洗脱效果的影响，通过比较回收率平均值和RSD确定最合适的洗脱溶剂。

（4）洗脱溶剂比例的优化

在确定固相萃取洗脱步骤中的最佳洗脱溶剂后，进而优化洗脱溶剂的比例，本试验选定的乙酸乙酯与乙醚的比例分别为5∶95、10∶90、20∶80、30∶70（V/V），通过比较回收率平均值和RSD，得到最优洗脱溶剂比例。

（5）反应时间的优化

葡萄酒样品进行检测时，将荧光反应时间设置为不同的时间范围，分别为5 min、15 min、30 min、45 min、60 min，通过比较回收率平均值和RSD，得到最佳反应时间。

1.3.5 方法学研究

（1）线性范围和线性方程

在最佳萃取及检测条件下，得到峰面积（Y）与EC含量（X）之间的关系曲线，进而得到线性方程和线性范围。

（2）精密度实验

对同一葡萄酒样品进行6次重复测定，测定精密度实验结果的RSD。

（3）加标回收率实验

检测葡萄酒样品中的EC含量，然后向葡萄酒中加入EC标品后，再次检测加标后的EC含量。分别吸取EC标准溶液（50 mg/L）0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL置于10 mL容量瓶中，并用葡萄酒样品定容，得到加标量为50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L的葡萄酒样品，计算加标回收率。

1.3.6 数据分析

实验过程中每个样本设置3个平行，并计算重复样本的平均值和标准偏差。用SPSS 19.0进行差异显著性分析，采用Origin 2019b软件进行制图。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 吸附时间的优化

葡萄酒样品进行萃取时，研究不同吸附时间下EC的回收率，试验结果见表2。

表2 不同吸附时间对葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影响Table 2 Effect of different adsorption time on ethyl carbamate in wine

由表2可知，不同吸附时间下，其回收率和相对标准偏差大有不同，在吸附时间4 min时，氨基甲酸乙酯的平均回收率最低，且相对标准偏差较大。随着葡萄样品萃取吸附时间的增加，回收率平均值趋于先增大后降低的趋势，而相对标准偏差呈现相反的趋势，当吸附时间为10 min时，平均回收率为88.9%，接近100%，相对标准偏差为2.32%，该吸附时间下提取EC效果最好。

2.1.2 淋洗溶剂的优化

在葡萄酒样品被吸附后，使用极性溶剂进行淋洗，可以有效去除色素、糖分等杂质，而氨基甲酸乙酯还可以有效的留在固相萃取柱上，试验中通过正己烷、乙酸乙酯、甲苯作为淋洗剂，以此确定最佳淋洗溶剂，结果见表3。

表3 不同淋洗溶剂对葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影响Table 3 Effect of different washing solvents on ethyl carbamate in wine

由表3可知，使用不同的溶剂进行淋洗时，其回收率和相对标准偏差也不同，当使用甲苯进行淋洗时，EC不能够很好的留在固相萃取柱上，故平均回收率最低，相对标准偏差为6.67%；使用乙酸乙酯淋洗时，其回收率平均值高于甲苯，为75.0%，且具有最大的相对标准偏差为11.07%；使用正己烷进行淋洗时，发现EC物质能够很好的保留在固相萃取柱上，此时平均回收率为89.5%，相对标准偏差为4.83%，正己烷提取EC效果最好。

2.1.3 洗脱溶剂的优化

（1）洗脱溶剂种类的选择

在确定淋洗溶剂后，根据EC的性质，选取乙酸乙酯、乙醚、乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）3种溶剂作为洗脱溶剂，结果见表4。

表4 不同洗脱溶剂对葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影响Table 4 Effect of different elution solvents on ethyl carbamate in wine

由表4可知，使用不同洗脱溶剂时对氨基甲酸乙酯的提取作用也不同，当洗脱溶剂为乙醚时，平均回收率仅为58.3%，相对标准偏差为4.29%，因此乙醚不适合作洗脱溶剂；使用乙酸乙酯时，其平均回收率为80.4%，相对标准偏差为3.38%；使用乙酸乙酯∶乙醚（5∶95）溶液时，该洗脱溶剂对洗脱效果的影响最好，此时氨基甲酸乙酯回收率达到95.1%。

（2）洗脱溶剂比例的优化

确定最优的洗脱溶剂后，进行洗脱比例的优化，结果见表5。

表5 洗脱溶剂比例对葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影响Table 5 Effect of elution solvent ratio on ethyl carbamate in wine

由表5可知，确定最佳洗脱溶剂后，对不同洗脱溶剂比例进行研究，发现随着乙酸乙酯与乙醚的体积比逐渐增加时，其平均回收率和相对标准偏差波动较大，说明洗脱溶剂比例对氨基甲酸乙酯的提取具有较大的影响；当乙酸乙酯与乙醚的体积比达到30∶70时，平均回收率最低为72.5%，相对标准偏差为1.52%，然而当乙酸乙酯与乙醚的体积比为5∶95时，平均回收率为92.5%，相对标准偏差为2.24%，其提取效果较佳。

从上述试验可以确定，采用固相萃取柱提取葡萄酒中的EC时，最佳固相萃取前处理：吸附时间为10 min，淋洗的弱极性溶剂为正己烷，洗脱溶剂为乙酸乙酯∶乙醚（5∶95，V/V）。

2.2 样品测定过程中反应时间的优化

在使用高效液相色谱测定样品中氨基甲酸乙酯的变化时，对荧光反应的时间进行优化，将其时间设定为5 min、15 min、30 min、45 min、60 min进行对比实验，结果见表6。

表6 反应时间对葡萄酒中氨基甲酸乙酯回收率的影响Table 6 Effect of reaction time on ethyl carbamate in wine

由表6可知，不同的荧光反应时间对葡萄酒中氨基甲酸乙酯的作用是不同的，随着反应时间的增加，葡萄酒样品中氨基甲酸乙酯的平均回收率波动较大，而相对标准偏差呈现先增加后减少的趋势，当反应时间为15 min时，其平均回收率最低为75.5%，相对标准偏差为5.9%；当反应时间为60 min时其平均回收率与5 min的平均回收率接近，为了考虑实用性，选择荧光反应时间为5 min。

2.3 标品及样品的色谱图研究

本实验流动相为乙腈-乙酸钠，最佳固相萃取前处理以及检测条件下得到的EC标准样品和葡萄酒样品的色谱图见图1。

图1 氨基甲酸乙酯标准品（A）和葡萄酒样品（B）的色谱图Fig.1 Chromatogram of ethyl carbamate standard (A) and wine samples (B)

由图1可知，在表1洗脱程序的试验下，获得了良好的色谱峰，该洗脱程序对EC分离度高、峰对成性良好，样品中的一些杂质可以与EC分开，因此可以用于葡萄酒中EC的检测。

2.4 线性范围和线性方程

在最佳条件下建立峰面积（Y）与氨基甲酸乙酯含量（X）的关系曲线，得到其线性方程为Y=1 125.891 64X+7.292 33，相关系数R=0.999 1，线性范围：10～1 000 μg/L。表明线性关系良好。

2.5 方法的精密度和检出限

对同一葡萄酒样品进行6次的重复试验，测定其氨基甲酸乙酯含量并计算RSD，结果见表7。

表7 葡萄酒样品中氨基甲酸乙酯测定方法的精密度试验结果（n=6）Table 7 Results of precision experiments of the determination method of ethy carbamate in wine samples (n=6)

由表7可知，6次重复测定结果之间存在差异，但差异较小，针对6次重复做平均值，发现葡萄酒样品中的EC平均含量为20.3 μg/L，相对标准偏差为2.9%，说明该检测方法的重现性良好。设置进样量为20 μL，以3倍信噪比（S/N=3）作检出限，得到检出限5 μg/L。

2.6 加标回收率试验

取相同的葡萄酒样品，分别吸取质量浓度为50 μg/L，100 μg/L，200 μg/L的氨基甲酸乙酯标品，按照上述方法进行测定，结果见表8。

表8 加标回收率实验结果Table 8 Results of standard addition recovery rate experiments

通过在葡萄酒中添加三个水平的EC标准溶液，按上述方法进行回收率实验，结果表明，葡萄酒样品测定结果平均回收率为88.5%～92.8%，相对标准偏差为2.9%～6.9%，平均回收率较高且相对标准偏差较小，说明该检测方法可以用来进行葡萄酒中氨基甲酸乙酯的而检测。

3 结论

本研究优化葡萄酒中EC含量测定的高效液相-荧光检测法。采用优化后的方法，精密度实验结果的相对标准偏差为2.9%～6.9%（n=6），加标回收率在88.5%～92.8%，EC检测限达到5 μg/L，操作快捷、精密度和回收率良好，容易掌握和进一步推广，可以将其用到葡萄酒样品中EC的测定。