蜡样芽胞杆菌毒素的最新研究进展

贾伟娟 宋丽丽 张玲艳 王学理

(内蒙古民族大学动物科学技术学院， 通辽 028042)

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)为兼性厌氧，产芽胞的革兰阳性杆菌。该菌属芽胞杆菌科，芽胞杆菌属，其大小为(1.0～1.2)μm×(3.0～5.0)μm，在8℃～55℃条件下可存活，但在环境pH较低(≤2)或含水量较低(≤0.95)时无法生存[1]。该菌形成的热稳定性孢子具有耐热、耐干燥、耐部分有毒化学物质及UV与γ射线等不利因素的特点[2]。蜡样芽胞杆菌为一种常见的条件致病菌，该菌与苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌等细菌的16S rRNA及生物学特性具有高度的相似性[3]。蜡样芽胞杆菌分为有毒菌株与无毒菌株，无毒菌株常被用作促植物生长剂及动物饲料内的微生物添加剂[4]。有毒菌株可引起动物和人类的食物中毒，偶见由该菌引起的皮下脓肿、眼部感染、菌血症等疾病[5]。临床上感染该菌后宿主多表现为呕吐与腹泻，呕吐症状是由该菌株产生的呕吐毒素(cereulide)所引起，而腹泻症状则主要由溶血型肠毒素Hbl(hemolysin BL)、非溶血型肠毒素Nhe(nonhemolytic enterotoxin)、细胞毒素CytK(cytotoxin)及其他几种腹泻型毒素引起[6]。此类产毒菌株多见于人类的食物中毒，早在1970年，美国就曾报道过由蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒，且在1998—2008年期间，美国每年发生940万例的食源性疾病中有130万例是由蜡状芽胞杆菌引起的[7-8]。在1977—2013年，德国、韩国和日本也相继出现由该菌导致的中毒事件，我国在1972—2018年期间，云南、江苏和北京等39个城市均报道过蜡样芽胞杆菌食物中毒事件[9-12]。通过数据整理后发现引起恶心、呕吐症状的污染食品大部分为米饭、包子和意大利面等淀粉含量较多的食品，导致腹痛、腹泻症状的主要食品有鸡蛋、肉类、乳制品和水产品[13]。对于该菌引起的食物中毒除抗生素外尚无其他有效治疗药物，由于药物与宿主之间的相互作用导致抗生素在宿主体内会产生副作用也容易导致耐药菌株的出现，因此抑制该菌的新的药物还在研发中。目前，有学者在蜡样芽胞杆菌中发现了新的药物靶点，将抗生素通过Schrödinger的Prime和Glide模块进行分子模拟和对接研究，其中庆大霉素与已鉴定的新靶点具有良好的亲和力[14]。因此可以通过寻找与庆大霉素类似的抑制剂并设计新的药物分子来控制蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒。近年来动物感染该菌的报道也日渐增加，在通辽地区已发现多起牛猝死病例。本实验室从通辽市某肉牛养殖场病死牛体内分离出1株蜡样芽胞杆菌，动物致病性试验结果发现该菌具有较强的致病性，经PCR检测该菌含有hbl、nhe、entFM等毒素基因以及管家基因groEL[15]。本文主要对蜡样芽胞杆菌的cereulide、Hbl、Nhe、CytK及HlyII等毒素的结构、功能及致病机制进行阐述，以期能为今后蜡样芽胞杆菌的研究提供理论基础，并为本实验室的下一步工作奠定基础。

1 呕吐型肠毒素

蜡样芽胞杆菌致吐株(bcemetic strains, Bce)可产生呕吐毒素(cereulide)，该菌株在亚洲较为常见，在淀粉类食品(米饭、土豆、面条等)中检出率较高，除此以外乳制品也为该菌的常见污染体[16]。在食入含有cereulide的食物0.5～6 h后，宿主会出现恶心、呕吐症状，严重者会发生肝衰竭而迅速死亡。现阶段在食品加工中还无法应用常规手段使cereulide失活。

Cereulide的分子量大小为1.2 kDa的一种环形十二烷基肽，由非核糖体肽合成酶合成，其结构为[D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]3，如图1所示[12,17]。Cereulide的合成受细菌内部因素及外界环境的共同调控。Bce在30℃～32℃，pH为7.0～7.5时的条件下产毒量最高，在细菌生长的对数期至稳定期期间Bce的产毒量逐渐减少。环境中的氧气含量、营养物质及水分等其他环境因素也会影响该毒素的产生。此外，细菌的密度也是影响产毒的因素之一，研究表明，当蜡样芽胞杆菌的密度达到阈值106CFU/mL时菌体开始产生毒素[18]。Cereulide较为稳定，耐高温，在126℃条件下可耐受90 min，且该毒素对消化酶具有很强的抵抗力。ces为控制合成cereulide的基因簇[NC_010924.1]，大小为24 kb，位于pBCE4810(也称pCER270)巨型质粒上，与炭疽杆菌的毒性质粒pXO1具有高度相似性[19]。pBCE4810由cesH、cesP、cesT、cesA、cesB、cesC和cesD组成，如图2[20]。其中cesPTABCD组成一个操纵子(cesoperon)，在主要启动子p1的驱动下转录成一条23kb的多顺反子mRNA链，而相邻的cesH由自身启动子PH驱动转录成单顺反子，并编码31 kDa的水解酶[21]。cesP编码的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶为非核糖体合成起始的重要元件，与其相类似，cesT也参与酶的合成。而cesA与cesB因对NADPH有高度亲和性，故在多肽组装时会起到重要作用[22]。cesC与cesD参与编码ABC转移体[23]。

当蜡样芽胞杆菌伴随食物进入机体后，cereulide自胃内释放进入十二指肠与5-HT3受体结合干扰神经感受器的信号传入，从而刺激迷走神经引起呕吐症状进而导致肠胃炎的发生[24]。Cereulide做为阳离子载体除与线粒体毒肽缬氨霉素在结构上具有相似性以外，在功能上也同样为特异性K+载体，且其对K+的亲和力高于缬氨霉素，即该毒素对哺乳动物毒性更强[25]。Cereulide对机体的损伤主要体现于对线粒体的破坏，该毒素引起线粒体膜上K+浓度升高，使线粒体发生肿胀、膜电势消失，从而使呼吸功能受到影响，此外，cereulide也会通过抑制脂肪酸氧化，来抑制线粒体活性，如图3[26-27]。Cereulide还可抑制自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)从而影响免疫，也会引起肝细胞变性进而引发急性肝衰竭，如图3[27]。据报道，cereulide在极低浓度下(4ng/g)能破坏胰岛B细胞，导致细胞凋亡和胰岛功能异常[28]。因此可猜想部分糖尿病的病因是与食入cereulide有关联。Bce除对动物机体产生作用外，也会对其他不产生呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌产生抑制作用。在土壤中，cereulide会帮助Bce搜取环境中的钾离子来保护菌体，此外Bce可抗真菌以实现对植物块茎的保护作用[29]。

对于该毒素的检测一直较为困难。最初对该毒素的检测是对猴子进行投喂试验。之后发现cereulide可使Hep-2细胞产生空泡化现象便以此来检测该毒素。Cereulide可损伤线粒体活性进而抑制猪精子的运动，该方法也被应用到cereulide的检测中。以上检测方法均不能检测到毒素本身，而在2004年Ehling-Schulz等[30]开发了针对ces基因的PCR检测技术，自此实现了对该毒素的快速检测。

2 腹泻型肠毒素

蜡样芽胞杆菌所产生的腹泻型肠毒素主要分为3类：溶血性肠毒素Hbl、非溶血性肠毒素Nhe与细胞毒素K(CytK)，此外肠毒素II(HlyII)、肠毒素FM(entFM)、肠毒素T(bceT)也具有致腹泻作用[31]。其中，Hbl与Nhe毒素为引起腹泻的主要毒素。据王远洋等[32]统计显示，食品内所检测出的蜡样芽胞杆菌中53.1%含有hbl基因，nheA、nheB和nheC的检出率分别为65.6%、90.6%、87.5%，entFM与bceT的检出率分别为96.9%和53.1%。由此可见腹泻型肠毒素在产毒芽胞杆菌中的存在率较高。宿主在摄入腹泻型肠毒素8～16 h后会表现出明显的腹泻症状。与呕吐毒素相区别，腹泻型肠毒素对外界的抵抗力较弱，55℃条件下作用5 min即可失活，此外腹泻型肠毒素易被胰蛋白酶等蛋白质水解酶分解，因此该类毒素较容易被去除[33]。

2.1 溶血性肠毒素

Hbl为腹泻型肠毒素的主要毒素之一，该毒素具有溶血性及细胞毒性，可导致皮肤坏死并增强血管通透性[34]。Hbl是由溶血毒素亚基L1、L2及亚基B结合而成的三元素复合体，各亚基的分子量大小依次为38.5、43.5和37kDa(图4)[12]。Hbl基因由hblA、hblB和hblC和hblD4个毒力基因组成，而有些Hbl会存在hblB的缺失现象。hblA、hblC、hblD分别控制L2、L1及B蛋白的合成，而位于hblCD下游的hblB因未曾检测到其任何转录现象，因此被定义为假基因。hbl操纵子的表达受多种调节蛋白的影响，如主要的毒力调节因子PlcR、CCPA、ResD和FNR[35]。编码合成Hbl的毒力基因多位于染色体上且几种毒力基因间相似性较高，因此3种毒素亚基存在同源异构现象[36]。

Hbl对细胞的破坏主要针对于细胞膜，通过Hbl的3个亚基依次与细胞膜进行结合，之后将结合部位的细胞膜溶解，形成孔洞，从而破坏细胞膜，如图5所示[27,37]。有研究表明，3种Hbl组分均能与红细胞结合，形成膜攻复合物，最终导致细胞裂解。在与细胞表面结合时，各毒素亚基须严格按照B-L1-L2的顺序进行结合才会产生细胞毒性。hblB与大肠埃希菌的溶血素E相似，该蛋白自身具有与细胞膜结合并打孔的功能，但当其作用于细胞时需在L1与L2的共同诱导下使构象发生改变后发挥细胞毒性作用。除结合顺序外，3种亚基的占比也是影响Hbl细胞毒性的关键因素。当环境中L2:L1:B=1:1:10与10:1:10时，细胞膜的孔隙形成速度最快[38]。

目前，Hbl的具体作用方式尚不清楚，除上述作用外，Hbl也会引起结扎的兔回肠发生积液[39]。近年有研究表明，Hbl可通过胞膜打孔导致K+外流，进而激活NLRP3炎症小体从而导致宿主的死亡，如图5[27,40]。与炭疽芽胞杆菌的致死毒素不同，Hbl无胞质依赖性，可直接刺激NLRP3，因此该毒素对宿主的致死作用可通过药物对NLRP3的抑制来进行预防[35]。

2.2 非溶血性肠毒素

在1995年挪威的食物中毒事件中Nhe首次被分离[41]。该毒素具有细胞毒性，但与Hbl不同，Nhe的溶血性较差，仅能作用于特定动物的红细胞[42]。Nhe最初被认为是由nheA、nheB及可检测到的大小为105 kDa的蛋白组成，随后该蛋白被证实为胶原酶而非Nhe的组件(图6)[12]。之后通过对nhe操纵子的测序，鉴定出编码nheC的第3组基因，经检测该基因所编码蛋白为Nhe的组成蛋白(图6)[43]。Nhe蛋白由NheA、NheB和NheC3种蛋白亚基组成，各蛋白亚基大小分别为41、39和36 kDa。Nhe的3种蛋白亚基基因的表达均由其操纵子启动区的Plc R-box进行调控[44]。Nhe的3种亚蛋白均由Sec系统分泌，且在分泌过程中各蛋白互不干扰，各自独立分泌至细胞外[45]。

Nhe亚蛋白释放到菌体外后NheB与NheC进行组装形成寡聚体，在NheC单体诱导下，宿主细胞膜表面受体与寡聚体中的NheB结合[46]，随后NheA与寡聚体结合形成复合体使细胞膜产生孔洞，导致胞内离子外流，最终致使细胞在胶体渗透作用下溶解死亡，如图7[12,26]。Nhe对多种细胞均存在细胞毒性，作用于不同细胞时所表现的毒性也不一致。Nhe的毒性靶细胞主要为上皮细胞，有研究表明其对肾上皮细胞与肠上皮细胞的IC50分别为4.7与10.8 ng/mL[47]。另有研究显示，当NheA、NheB和NheC的摩尔比为10:10:1时Nhe对Vero细胞的毒性作用达到最大，且当NheC过量时，会对Nhe的毒性产生抑制[48]。与NheC不同，NheB对毒素的毒力有着至关重要的作用，当加入特异性抗体等可以与NheB进行结合的物质后，Nhe的细胞毒性几乎完全消失[48]。NheA的细胞毒性作用不强，但其对细胞活性存在一定的影响，该亚基的具体作用有待于进一步研究。

2.3 细胞毒素K

CytK是一种单体蛋白，大小为34 kDa，具有细胞毒性、溶血活性、可使皮肤发生坏死。

CytK属β致孔毒素家族，该家族内毒素均为水溶性单体，在作用于细胞时将自身的成孔区插入细胞膜致使跨膜孔的形成。与其位于同一家族的毒素包括产气荚膜梭菌的β-毒素[49]、金黄色葡萄球菌的α-溶血素[50]及蜡样芽胞杆菌的HlyII等。在1998年法国疗养院发生严重食源性中毒的蜡样芽胞杆菌NVH 391/98菌体内CytK首次被分离[51]，该菌会引起严重腹泻，并具有致死性。该毒素蛋白由cytK基因进行编码，在PlcR的调控下进行表达。与Hbl、Nhe相同，CytK的氨基酸序列内也含有分泌信号肽，这表明该毒素同样由Sec系统进行分泌[52]，此外，该毒素的毒性作用与Hbl、Nhe相类似。

2004年，CytK的变异体CytK-2于NVH 1230/88菌株内被分离。对两种毒素蛋白进行分析，二者的差异主要集中于蛋白的特定区域内，继而表明毒素基因表达水平决定其对细胞的毒性作用强弱[53]。目前对与CytK的研究较少，该蛋白在作用于细胞时会对细胞膜进行打孔，继而使磷脂双分子层对钾离子具有透过性，同时细胞外液流入细胞，最终导致细胞发生死亡，如图8[27]。

2.4 肠毒素II

肠毒素II(HlyII)为蜡样芽胞杆菌的毒素之一，田万帆等[54]调查显示该毒力基因在致病性蜡样芽胞杆菌中的检出率为29%。HlyII对人类细胞系具有溶血性和细胞毒性，单独存在时不具有致腹泻作用，但其与CytK共同作用时可加强腹泻程度。该毒素大小为42.3kDa，具有94个氨基酸，与CytK同属于β致孔毒素家族。对比该家族的其他毒素，HlyII的C-末端延伸并非是形成孔隙或发挥溶血作用的必须之处。该毒素对多种动物的红细胞有着不同程度的毒性，其与细胞膜的结合为非特异性，即细胞膜上无需具备HlyII的特异性受体，如图8[27,55]。HlyII不受PlcR调控而是由转录调节因子HlyIIR对其进行负调控，直接编码在HlyII下游[56]。HlyII的启动子内含有与转录起始位点重叠的铁摄取调节因子(Fur)结合位点，在环境中铁含量发生改变时通过对该基因的抑制或刺激来维持细菌生长中所需铁量[26]。

除上述几种主要的肠毒素外，蜡样芽胞杆菌还具有肠毒素T(BceT)、肠毒素FM(entFM)、InhA2、溶血素(溶血素O、溶血素II、溶血素III)和降解酶(3个磷脂酶C)等几类可致腹泻的毒素。但因其毒性作用不明显，故对上述毒素研究较少，具体作用效果及作用机制有待于进一步的研究。针对肠毒素的检测早在90年代就有基于Nhey与Hbl抗体的检测试剂盒、检测Hbl的L2的BCET-RPLA试剂盒以及ELISA。现阶段针对于肠毒素的检测主要为普通PCR、多重PCR的定性检测及荧光定量PCR的定量检测[57]。

2.5 肠毒素产生的调节

蜡样芽胞杆菌毒素的毒力水平不仅取决于毒力基因，还取决于菌体所处外界环境。在环境恶劣，营养匮乏之时菌体会选择性的限制合成与运输过程中能量消耗过高的毒素的生成，以此来维持菌体的生存[58]。此外，菌体的生长温度对毒素的产生也具有很大的影响，但其作用机制尚不明确。细菌毒力因子的表达通常是几种因子协调作用的结果，因此毒力蛋白的合成除编码蛋白的决定因子外，通常还需额外基因进行调节。蜡样芽胞杆菌的多数毒力蛋白的表达均由转录激活剂PlcR参与调控[59]。此外，蜡样芽胞杆菌各毒素的合成水平及合成阶段具有明显的差异性，Nhe在指数期分泌量最高，而Hbl则在稳定期含量最高，由此可见毒素的合成是由多种因素共同调控完成的。

3 蜡样芽胞杆菌病的防控

蜡样芽胞杆菌广泛存在于土壤、空气和水体环境中，因此该菌不可避免地会污染食品[60]。研究表明，当食物中蜡样芽胞杆菌的检出量为1×102CFU/g就能够引发食物中毒，这类被污染的食物往往并未引起感官变化，但是可以使宿主致病[61]。夏季气温更接近蜡样芽胞杆菌的最适生长温度，食物容易腐败变质，因而夏季是该菌引发食物中毒的高发期。减少蜡样芽胞杆菌中毒的关键是要避免该菌在食物中大量生长和产生毒素，可从以下几个方面进行预防。

3.1 日常食品的处理

大米、腐乳和乳制品等均可以被蜡样芽胞杆菌污染，因此在食品原材料加工阶段要严格控制蜡样芽胞杆菌的含量。在烹饪时需要注意食物的加热温度和加热时间，烹饪后的食物如果不立即食用，应冷藏处理，避免蜡样芽胞杆菌的生长繁殖。蛋白质丰富的食物与米饭、面条、包子等淀粉含量高的食物放在一起会加快蜡样芽胞杆菌生长，所以这些食物要分开存放。蜡样芽胞杆菌污染饲料导致动物中毒的事件也屡有发生，严重威胁到动物养殖和食品安全。因此须开发更高效、低廉的微生态制剂监控与检测该菌的含量，以阻断蜡样芽胞杆菌及其毒素对动物健康的威胁。

3.2 注意环境卫生

蜡样芽胞杆菌无处不在，因而食品加工所用的仪器设备要经常清洗，避免污染。加工车间不应有昆虫、老鼠以及杂物出现，维持地面清洁，以免造成蜡样芽胞杆菌的残留和二次污染。

3.3 选择合适的消毒剂

清洁完成之后要使用消毒剂对仪器设备进行消毒。最常用的消毒剂是浓度为75%的酒精，但其却不能杀灭产芽胞的细菌。过氧乙酸可以杀灭真菌、细菌、芽胞以及病毒，但其具有腐蚀性和易挥发性，使用时需现用现配。

4 总结与展望

近年来随着抗生素等药物的滥用和乱用，有毒蜡样芽胞杆菌的侵袭力也在不断的发生变化。Veysseyre等[62]对一所医院5年内确诊为感染蜡样芽胞杆菌患者的临床症状进行统计，结果显示29.8%的患者发生单纯菌血症，28.1%的患者发生皮肤感染，17.5%的患者发生骨及关节感染，11.8%的患者发生死亡，54.4%的患者在内科进行治疗。该细菌所针对的靶器官从最初的胃肠道扩展到其它脏器，甚至可使宿主死亡，可见蜡样芽胞杆菌的侵染能力逐渐增强。此外，该菌对动物的侵袭力也在逐步增强，其宿主的种类也在逐渐增多，有研究显示，猪、马、鼠、牛、鳖、鸽子及家蚕等均为该菌的易感动物[15,41,55,63-65]。

蜡样芽胞杆菌与金黄色葡萄球菌肠毒素引起的中毒症状十分相似，因此，蜡样芽胞杆菌所导致中毒事件常常被忽视。长期滥用抗生素致使耐药基因的出现，大大增加了感染的几率。在国内将其作为益生菌使用过程中，虽然在安全性有一定的评估和监督，但还是有一定的疏漏，因此作为益生菌使用前应进行全面检测，以确定菌株的安全性。蜡样芽胞杆菌的毒力因子与细菌致病性的强弱相关联，随着对该菌各种毒素的深入研究，越来越多的研究显示，蜡样芽胞杆菌的毒素不仅具有细胞活性，很多毒素还对宿主机体的免疫系统等方面产生影响。此外，该菌所分泌的毒素不易通过普通手段进行去除。因此，可暂时通过对菌体的防控来实现对该菌及毒素所致疾病的预防，同时有必要开展相关调查，以增加对蜡样芽胞杆菌菌株毒素的研究，进一步对疾病预防提出有效措施。