微阵列芯片法与荧光PCR熔解曲线法在耳聋基因筛查中的比较分析*

曹国梅 张陆岩 黄春红 朱子成

1 宁波明州医院检验科，浙江省宁波市 315000； 2 北京博奥生物技术有限公司； 3 厦门致善生物科技股份有限公司

听力障碍是我国第二大出生缺陷疾病[1]。耳聋对婴幼儿的语言发育造成严重影响，并对患儿的家庭造成巨大的经济和精神负担。目前认为，婴幼儿出现听力障碍主要与环境因素、遗传因素有关。听力筛查是既往发现新生儿听力障碍的重要方式，自2003年开始，我国开始对新生儿开展听力障碍的筛查工作，新生儿出生3d内一般会安排1次常规听力筛查，对筛查未通过的新生儿，需在42d内进行复筛。随着相关研究的逐步深入，常规筛查方式对新生儿听力障碍的筛查缺陷逐渐显现，即不能及时发现迟发性耳聋患儿。

临床资料显示，部分未通过听力筛查(初筛)的患儿需要在数月后经过诊断性检查才能确诊，而部分迟发性患儿在2～3岁时才会表现出明显的听力障碍。与常规筛查策略相比，耳聋基因筛查的准确率更高，将两种方法进行结合使用，能够将新生儿听力障碍的确诊时间提前至7～14d，同时排除其他因素对筛查结果的干扰作用[2]。本文围绕新生儿耳聋的基因筛查方法展开分析，重点比较荧光PCR熔解曲线法、微阵列芯片法在新生儿耳聋基因筛查中的表现，探讨两种筛查方法是否能够满足临床筛查的需要，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 筛查对象 选取2019年7月—2021年1月本院产科病房出生的20例新生儿(3d内)，采集20例干血斑样本，其临床结果已知。分别使用微阵列芯片法、荧光PCR熔解曲线法进行筛查。新生儿家长知情同意并签署同意书。

1.2 试剂盒与仪器 (1)微阵列芯片法：选用十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒(微阵列芯片法，试剂批号：20190603，生产厂家：北京博奥晶典生物技术有限公司)，其他主要仪器有晶芯SlideWasher洗干仪(生产厂家：博奥生物集团有限公司)、LuxScan 10K/B晶芯微阵列芯片扫描仪(生产厂家：博奥生物集团有限公司)、S1000 PCR仪(生产厂家：BioRad)。样本处理与检测方法参考试剂盒的标准操作规程，结果由分析系统自动判读。若探针监测信号值≥探针cut off 值，结果为阳性；反之，结果为阴性。(2)荧光PCR熔解曲线法：选用遗传性耳聋基因检测试剂盒(PCR熔解曲线法，试剂批号：210051001，生产厂家：厦门致善生物科技股份有限公司)，其他仪器主要有SLAN-96S全自动医用PCR分析系统。样本的处理与检测方法参考试剂盒的操作规程，结果由分析系统给出。

1.3 方法 本次对比试验的主要目的是验证基因筛查方法的准确性、重复性以及检出限。具体验证方案如下。准确度验证：利用试剂盒对20例干血斑样本进行检测，并将实验室检测结果与临床结果进行对比。重复性验证：选取2例样本，对样本进行3次重复检测，对比检测结果与预期结果。检出限验证：根据试剂盒说明书要求的被检DNA浓度下限，选取1例结果已知的干血斑样本并提取核酸，对核酸浓度进行测定，将其稀释到3～25ng/μl水平，并进行灵敏度验证。

2 结果

2.1 准确度验证 微阵列芯片法与荧光PCR熔解曲线法的检测结果基本一致，20例样本中有8例阳性样本，12例野生型样本。实验室检测结果与临床已知结果一致，微阵列芯片法与荧光PCR熔解曲线法的准确率为100%，详见表1。

表1 两种检测方法的准确度验证结果

2.2 重复性验证 微阵列芯片法结果显示，重复3次检测的结果一致，与临床已知结果相吻合。详见表2。荧光PCR熔解曲线法的重复性验证结果显示，4例样本每个通道Tm值的变异系数(CV)均≤5%，符合验证要求。详见图1。

表2 微阵列芯片法的重复性验证结果

2.3 检出限验证 微阵列芯片法结果显示，在核酸浓度降低至检测下限后，该试剂盒仍然能够准确地检测出突变位点，其结果如表3所示。荧光PCR熔解曲线法结果显示，稀释至检出限下限后试剂盒仍然能够准确地检测出检出限样本，其验证结果如表4所示。

表3 微阵列芯片法灵敏度验证结果

表4 荧光PCR熔解曲线法的检出限验证结果

3 讨论

基因筛查是利用现有医学检测手段对受检者的遗传信息进行检测，从中发现目标改变的过程，筛查结果对个体患病风险的判断以及用药治疗等有重要的参考价值。针对新生儿耳聋，通过现有的基因检测方法对遗传性耳聋相关的基因位点进行检测，能够准确判断新生儿的耳聋风险或听力障碍的病因，从而积极采取干预措施。回顾性分析新生儿耳聋基因的筛查结果，新生儿耳聋主要与GJB2基因、SLC26A4基因、线粒体12SrRNA基因、GJB3基因有关[3-7]。新生儿耳聋基因的筛查有多种检测方法，不同检测方法的检测原理、适用条件、检测效果以及检测过程所需的仪器、设备等存在差异，而早期筛查工作的开展由于缺乏统一的标准，以及检测过程中的不当操作，基因检测的结果难以获得有效的保障。目前认为，遗传性耳聋基因筛查的局限性主要表现在检测技术、检验范围以及结果解读等方面[8]。在对基因检测过程进行严格质量控制并完善检测过程管理体系的情况下，现有的基因变异筛查方法仍然不能完全避免假阴性、假阳性结果的出现，为此，在出现争议结果时，需要有两种不同的技术检验方案进行验证。

在现有的检测方法中，微阵列芯片法是比较主流的筛查技术，罗会涛等[9]利用微阵列芯片法对新生儿进行上述四个基因的15个突变位点进行检测，并就该方法对先天性耳聋基因的筛查价值进行了论证。本文选取15项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒，对其检测性能进行验证。从原理层面看，此类试剂盒的模板为人基因组DNA，检测对象为遗传性耳聋相关基因的15个突变位点，检测时由带有Tag标签序列的基因位点特异性引物实现检测对象的扩增、荧光及生物素标记，之后进行磁分离、碱变性，通过与通用基因芯片的杂交与扫描分析，得到15个突变位点的检测结果。在检测过程中，本方法对样本有一定的要求：(1)上游标本为人全血时，抗凝剂不得使用肝素，检测结果不受受检者个体的饮食、服用状况等因素的影响；(2)上游标本为人滤纸干血斑时，检测人员需要对采血过程、样本的管理等进行严格管理。为了解该试剂盒的检测性能，本次试验选取了20例临床结果已知的干血斑样本，样本采集过程和检验过程均参考实验室管理规范以及试剂盒操作规程，并采取不同的方式对20例样本进行检测，以验证试剂盒的准确度、重复性以及检出限。对比临床检测结果与试剂盒检测数据，结果发现，20例样本检测结果的准确率为100%，2例样本重复3次检验的结果均与临床已知结果相符，样本稀释至检测下限后，试剂盒仍能够准确地检测出突变位点。而从基因检测的实现过程来看，该方法需要将一定数目的DNA探针进行固定，检测类型有限，检测项目未涵盖所有与新生儿耳聋相关的全部基因与突变位点，不能有效地检测出突变率较低的基因类型与突变位点。

荧光PCR熔解曲线法主要通过荧光标记探针与PCR产物形成的双链杂交体的溶解曲线分析掌握样本基因情况[10-11]。在用于遗传性耳聋基因检测的检测时，本方法需要用引物扩增人的4个常见耳聋基因，然后对双链杂交体进行溶解曲线分析，根据分析结果对受检者4个常见耳聋基因是否有突变以及具体的突变类型进行判读。此次试验所用的试剂盒由厦门致善生物科技股份有限公司生产，配套全自动医用PCR分析系统，每份样本需要在4个PCR反应体系内完成检测，对应扩增试剂中的耳聋PCR反应管。验证其性能时，对20例临床样本进行检测，结果显示，检测结果与临床已知结果完全吻合，准确率100%。重复性验证发现，4例样本每个通道Tm值的变异系数(CV)均≤5%，符合验证要求。验证样本稀释后试剂盒检测的准确性，结果表明，稀释至检出限下限后试剂盒仍然能够准确地检测出检出限样本。因此，荧光PCR熔解曲线法能够满足新生儿耳聋基因的临床筛查需求。临床适用性方面，荧光PCR熔解曲线法避免了烦琐的检测程序以及高额的筛查成本，具备在新生儿听力障碍临床筛查工作中大规模应用的可能性[12-13]；利用试剂盒进行常见基因的突变位点筛查，检测过程的历时较短，检测位点的选择相对灵活，能够根据受检者的实际情况制定个性化的检测方法[14-15]。本次研究结果提示，上述两种方法对新生儿耳聋基因的筛查有明确的诊断价值，能够为临床筛查工作提供可靠的参考信息，在考虑有假阴性、假阳性等情况时，或者筛查过程中出现争议时，可同时应用两种方法进行基因检测，互为验证。

综上所述，微阵列芯片法与荧光PCR熔解曲线法对新生儿耳聋基因的筛查有显著的临床价值，相关试剂盒在检验过程中的准确性、重复性以及检出限验证结果均通过，提示两种方法均可用于临床筛查。但临床实践中，两类试剂盒涉及的方法学、检验原理与检测过程存在一定的差异，可根据实际筛查需求合理选取筛查方法。