lncRNA C2dat2调控小鼠大脑中动脉栓塞再灌注损伤及神经元自噬和凋亡

贾文歆， 于振江， 王丽香， 周雪梅

(济南市第八人民医院神经内科，山东省济南市 271104)

缺血性脑卒中又称脑卒中，是心脑血管疾病中常见类型，具有高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率的特点，是全世界第二大死因[1]，目前缺乏有效治疗方法，对存活者生存质量造成严重影响。中枢神经系统是大脑认知功能基础，大脑缺血再灌注通常会伴有神经功能受损，且其损伤不可逆[2]，故此保护神经功能，促进神经功能恢复进而降低致残率已成为目前缺血性脑卒中亟需解决的难题。长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)不具有编码蛋白功能[3]，但其在表达遗传调控、转录水平及转录后调控等多方面发挥重要作用[4]。有研究证实，lncRNA C2dat2可以促进脑出血后神经元存活[5]。但lncRNAs在动脉栓塞再灌注过程中的调控作用尚不明确。本研究就lncRNA C2dat2对小鼠大脑中动脉栓塞再灌注损伤(middle cerebral artery occlusion-reperfusion injury，MCAO/R)及神经元自噬、凋亡的影响进行了研究，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂

二氧化碳培养箱购自合肥赛帆试验设备有限公司；RNA提取试剂TRIzol及转染试剂Lipofectamine 2000购自武汉极捷生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液及BCA法蛋白测定试剂盒购自金克隆(北京)生物技术有限公司；ECL发光液、苏木精-伊红染色液购自北京伊塔生物科技有限公司；TUNEL细胞凋亡试剂盒购自武汉益普生物科技有限公司；LONZA ELx808酶标仪购自北京泽平科技有限责任公司；Bio-Rad伯乐PCR仪T100购自南京贝登医疗股份有限公司；磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase，p-p38MAPK)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine protease protein，Caspase-3)、兔抗大鼠LC3多克隆抗体和兔抗大鼠LC3Ⅱ多克隆抗体、Beclin 1山羊多克隆抗体和GAPDH、β-actin购于Cell Signaling Technology公司。shRNA由上海汉恒生物技术有限公司设计并提供。

1.2 动物及分组

清洁级SD小鼠60只，8周龄，雌雄各半，体质量(20.01±2.11)g，购于吉林四长制药有限公司，许可证号SYXK(吉)2020-001。饲养于标准环境中，饲养条件是光照/黑暗时间各12 h，相对空气湿度45%～55%，温度22～26 ℃，可自由进食进水，适应性喂养1周。在整个实验过程中对动物的处置均符合医学伦理学标准。实验分为假手术组、模型组、negative shRNA组和C2dat2 shRNA组，每组15只小鼠，后两个shRNA组模型建立后在小鼠侧脑室用0.5 ng/kg相应shRNA注射。

1.3 MCAO/R模型建立

参考文献[6]，采用10 g/L戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉小鼠，沿颈部正中备皮消毒后切开皮肤，钝性分离皮下组织和肌肉组织，露出颈总、颈外和颈内动脉；将尼龙鱼线制成的线栓自颈内动脉穿入，经颈总动脉栓塞大脑中动脉；血管阻塞60 min后拔出线栓，恢复灌注。假手术组不阻断颈总动脉，其余操作与其他组相同。

1.4 脑组织病理观察

经腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠麻醉小鼠，采用脱颈椎法处死小鼠，取出脑组织，固定于10%福尔马林溶液中，采用常规方式进行脱水、包埋、切片处理。经苏木精-伊红(HE)染色后，置于显微镜下观察。

1.5 神经功能缺陷评估

通过改良神经功能缺陷评分[7]评价小鼠神经功能改变情况，评分内容包括提尾实验、行为功能、感觉实验、平衡木实验及反射实验，总分20分，分值越高行为缺陷越严重。

1.6 TUNEL染色法检测细胞凋亡

取出的脑组织脱水后浸蜡包埋，然后将蜡块切成厚度5 μm的切片，脱蜡后进行TUNEL染色。中性树胶封片，显微镜下观察切片中脑组织细胞的凋亡水平。

1.7 实时荧光聚合酶链反应检测Caspase-3、p-p38 MAPK mRNA表达

实时荧光聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测Caspase-3、p-p38 MAPK mRNA表达。采用TRIzol法提取组织总RNA，采用紫外分光光度计法测定RNA水平。按TaqMan® MicroRNA反转录试剂盒说明书以RNA为模板进行反转录获得cDNA，置于4 ℃保存，进行荧光定量PCR扩增，设置反应条件：95 ℃5 min预变性；95 ℃变性10 s，60 ℃退火35 s，65 ℃延伸30 s，扩增35个循环。以β-action为内参，Caspase-3上游：5′-GAGCTTGGAA CGCGAAGAAA-3′，下游：5′-TCAATACCGCGCAGTCCAGCTC-3′；MAPK上游：5′-GAGCTGCGTCGAAC CGT-3′，下游5′-CCTCCCAGACGGTCTTGTTC-3′；β-action上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-ACGCTTCACG AATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCT法计算Caspase-3、p-p38 MAPK mRNA相对表达量。

1.8 Western blotting检测自噬蛋白

取梗死周围区域脑组织，放入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Belin 1自噬蛋白水平。沸水浴中10 min，电泳后转膜，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h。加入一抗(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜。次日PBS洗涤3次，然后加入相应二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，PBS洗涤3次，发光液进行显色，以GAPDH为内参。在ECL试剂盒进行显影。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 lncRNA C2dat2对大脑组织病理学改变的影响

假手术组小鼠大脑组织结构清晰，神经元细胞胞体大小正常，呈多角形，染色均匀，核仁明显。模型组大脑皮层区出现明显缺血灶，脑组织明显水肿，神经细胞排列无规则，并可见大量细胞变性坏死。negative shRNA组与模型组病理改变类似。C2dat2 shRNA组与假手术组组织形态接近，有少量神经细胞坏死(图1)。

图1 lncRNA C2dat2对MCAO/R小鼠大脑组织病理学改变的影响(HE染色，200×)

2.2 lncRNA C2dat2对神经功能的影响

与假手术组比较，小鼠神经功能缺陷评分其他组均明显升高，且同组比较，评分随时间依次下降，C2dat2 shRNA组评分低于同时间negative shRNA组(P<0.05；表1)。

表1 lncRNA C2dat2对MCAO/R小鼠神经功能缺陷评分的影响(n=15) 单位：分

2.3 lncRNA C2dat2对大脑细胞凋亡的影响

模型组和negative shRNA组细胞凋亡率高于假手术组，C2dat2 shRNA组细胞凋亡率低于negative shRNA组(P<0.05；图2)。

图2 lncRNA C2dat2对MCAO/R小鼠大脑细胞凋亡的影响(TUNEL染色，200×)1为假手术组；2为模型组；3为negative shRNA组；4为C2dat2 shRNA组。a为P<0.05，与假手术组比较；b为P<0.05，与模型组比较。

2.4 lncRNA C2dat2对脑组织自噬蛋白水平的影响

模型组和negative shRNA组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Belin 1水平高于假手术组，C2dat2 shRNA组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Belin 1水平低于negative shRNA组(P<0.05；图3)。

图3 lncRNA C2dat2对MCAO/R小鼠脑组织自噬蛋白水平的影响1为假手术组；2为模型组；3为negative shRNA组；4为C2dat2 shRNA组。a为P<0.05，与假手术组比较；b为P<0.05，与negative shRNA组比较。

2.5 lncRNA C2dat2对Caspase-3和p-p38 MAPK mRNA水平的影响

模型组和negative shRNA组Caspase-3和p-p38MAPK表达水平高于假手术组，C2dat2 shRNA组Caspase-3和p-p38MAPK表达水平低于negative shRNA组(P<0.05；表2)。

表2 lncRNA C2dat2对MCAO/R小鼠脑组织Caspase-3和p-p38MAPK mRNA水平的影响(n=15)

3 讨 论

本研究构建小鼠大脑中动脉栓塞再灌注损伤模型，经脑侧注射negative shRNA或C2dat2 shRNA，观察小鼠脑组织病理变化，发现模型组小鼠大脑皮层区出现明显的大脑动脉栓塞再灌注的特征；而C2dat2 shRNA组小鼠大脑组织形态与正常小鼠大脑组织形态基本接近，可见少量神经坏死细胞。研究结果表明，降低C2dat2表达可能可以减轻小鼠大脑损伤。lncRNAs是一类不具有编码蛋白质能力的RNA，属于线性RNA[8-9]。lncRNAs参与调节细胞分化、发育、防御以及免疫应答系统等多种重要的生物行为过程[10]。lncRNAs在人类肿瘤中的作用研究最为深入，而在心脑血管疾病中的研究起步较晚。既往研究显示，lncRNA-CARL通过抑制机体线粒体分裂和心肌细胞凋亡，从而降低脑缺血再灌注对神经的损伤[11]。为进一步分析C2dat2在MCAO/R模型小鼠中发挥的作用，本文进行小鼠神经功能学评分发现，C2dat2 shRNA组神经功能缺陷评分明显低于模型组和negative shRNA组，说明降低C2dat2表达可减轻MCAO/R对大脑神经功能的损伤。既往研究显示，脑梗死早期血清lncRNA XIST与急性脑梗死早期神经功能缺损有关，可作为脑梗死潜在分子靶点[12]。本研究结果还发现，C2dat2 shRNA组细胞凋亡率显著少于模型组，而模型组多于正常小鼠，提示MCAO/R可造成脑细胞大量死亡，减低C2dat2表达可有效抑制脑细胞坏死。C2dat2 shRNA组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和Belin 1表达水平明显低于模型组；而模型组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ和Belin 1表达水平高于假手术组。自噬是通过吞噬自身细胞内大分子物质和细胞器，体现细胞本身代谢需要和细胞器更新的过程[13]。在受损的细胞器激活细胞坏死或凋亡之前，适时清除受损的细胞器是一种重要的保护机制，以完成细胞自身的代谢需要和细胞器的更新，对于稳定细胞正常的生长和代谢具有重要作用。人们发现自噬与神经元损伤有关，发挥了神经保护作用，而自噬又与细胞凋亡密切相关。近年来，自噬被认为是除细胞坏死和凋亡之外的一种细胞死亡方式，但在大脑的缺血再灌注损伤中，适度自噬可以激发身体自我修复能力，有利于大脑的神经损伤的修复，而当自噬被过度激活后，则进一步促进受损脑神经细胞死亡，加重病情发展[14-15]。本研究发现，降低C2dat2表达可抑制机体自噬过度激活，减轻细胞坏死，起到保护大脑细胞的作用。

此外，C2dat2 shRNA组Caspase-3和p-p38MAPK表达水平明显低于模型组；模型组Caspase-3和p-p38MAPK表达水平明显高于假手术组。Caspase-3又称为死亡蛋白酶，是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，是凋亡的细胞内途径和细胞外途径共同的下游效应分子，也是细胞凋亡的必经之路[16]。p38 MAPK信号通路可以在细胞外刺激下激活，激活的p38在炎症、细胞凋亡中发挥重要作用[17]。当脑梗死发生后，缺血区内的神经细胞及星形胶质细胞中p38 MAPK的活性被激活，参与调节细胞凋亡过程[18]。本研究结果说明，降低C2dat2的表达可抑制小鼠大脑细胞凋亡和自噬，其可能是通过抑制Caspase-3和p-p38MAPK表达实现的。

综上所述，MCAO/R损伤程度与C2dat2的表达高低有关，降低C2dat2表达可减轻MCAO/R损伤，抑制大脑细胞凋亡和自噬，其可能与MAPK信号通路有关。本研究结果尚存在一定的局限性，神经细胞损伤修复的机制很复杂，往往是多方面因素共同作用的结果，需要大量实验数据进行验证。