紫花苜蓿与垂穗披碱草混播比例对其抗寒生长生理特征的影响

刘彩婷，毛丽萍，阿依谢木，3，于应文，3，沈禹颖，3*

（1. 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020；2. 兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃 兰州 730020；3. 兰州大学草业科学国家级实验教学示范中心，甘肃 兰州 730020）

紫花苜蓿（Medicago sativa）含丰富的蛋白质，是世界上最重要的牧草，素有“饲草之王”的美称［1-2］。自2012年农业农村部启动“振兴奶业苜蓿发展行动”以来，我国紫花苜蓿需求量不断增加，每年政策性支持苜蓿种植面积为3.33×104~6.67×104hm2，据中国草业统计，截至2019 年全国苜蓿种植面积达231.8×104hm2，有力促进了草畜产业发展［3-4］。然而，在我国青藏高原地区，紫花苜蓿往往面临越冬率低的问题，制约着紫花苜蓿草地的建植与发展［5-7］，加之该地区牧草多以抗寒性强的禾草为主，家畜所需养分以能量类粗纤维为主，粗蛋白供应严重不足，难以满足草食家畜健康生长需求［8］。聚焦紫花苜蓿抗寒机理，可为高寒区引入蛋白含量高的优质紫花苜蓿，为该地区草地质量的提升提供技术保障，目前其已成为寒区苜蓿种植研究热点之一。

近年来，对紫花苜蓿抗寒性研究集中于其抗寒品种的筛选，有学者采用多点试验评估本地紫花苜蓿与引进品种的抗寒性，表明本地品种环境适应性强，其抗寒性优于引进品种［9］；耐寒性强的紫花苜蓿其根颈可溶性糖含量高，能防止细胞液凝结形成小冰晶对植物根系产生伤害而起到保护作用，与秋眠级无直接相关性［10］；紫花苜蓿对低温的响应，表现在其叶片的丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量均较对照有所提升［11］。研究表明，在松嫩平原，紫花苜蓿与无芒雀麦（Bromus inermis）、草地羊茅（Festuca pratensis）分别以30%比例混播时，越冬期其根系的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量分别较单播提高14.9%、3.1%和18.0%，表现出混播可提高苜蓿抗寒能力［12-14］。但在青藏高原高海拔地区，紫花苜蓿与当家草种垂穗披碱草（Elymus nutans）的混播能否提高其抗寒性，不同混播比例对紫花苜蓿苗期的抗寒生长表型及生理特征的综合影响尚不明确。因此，本研究在控制低温下，设置紫花苜蓿与垂穗披碱草4 个混播比例，研究不同混播比例下紫花苜蓿的地上、地下形态和植株生理特征对低温的响应，并采用隶属函数法对其低温适应性进行综合评价，为高海拔寒区紫花苜蓿草地的成功建植提供一定理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

盆栽培养于2021 年3 月至5 月在兰州大学榆中校区智能温室（35°56′N，104°10′E，海拔1720~1900 m）开展。试验材料为紫花苜蓿“龙牧806”（M. sativacv. Longmu 806，MS）（休眠级为1［15］）及垂穗披碱草，分别来源于黑龙江农业科学院和甘肃猛犸农业有限公司，纯净度分别≥90%和≥95%，发芽率分别为80%和85%。盆栽试验采用草炭∶蛭石∶河沙=1∶1∶1 混合基质培养，相对含水量为19.7%，pH 值为6.2，速效氮含量为128.6 mg·kg-1、速效磷含量为58.2 mg·kg-1、速效钾含量为130.5 mg·kg-1。

1.2 试验设计

混播设计：设置紫花苜蓿与垂穗披碱草4 个混播处理：紫花苜蓿占比分别为100%、70%、50%、30%，即MS100%、MS70%、MS50%和MS30%，各处理具相同播种密度（每盆10 株，花盆大小为直径21 cm×高12 cm），播深2.5~3.0 cm，株距2.0 cm。每个播种比例16 盆，4 次重复，共64 盆，完全随机排列放置。

温度处理：在25 ℃下育苗后，先转入15 ℃下低温培养10 d 后，再转入5 ℃下低温培养10 d（图1）。各低温阶段培养过程中，培养箱内光照设置为3 个阶段：6：00 am-9：00 am 和18：00 pm-20：00 pm 段为弱光照，光强为11000 lx；9：00 am-18：00 pm 为强光照，光强17600 lx；20：00 pm-次日6：00 am 为完全暗光。培养箱相对湿度为75%。

图1 温度处理过程Fig.1 The process of temperature treatment

1.3 测定指标与方法

1.3.1形态生长指标 分别在15 ℃下培养10 d 和5 ℃下培养10 d 后，测定如下指标：

株高、分枝数：用卷尺测定每盆每株紫花苜蓿绝对株高，并统计主茎基部着生的分枝数。

叶片形态：测定每盆中每株紫花苜蓿顶端复叶中间叶的叶长、叶宽。

生物量：每个混播比例下取4 盆，将每盆中苜蓿的地上与地下分开，地上部分直接在105 ℃杀青30 min 后，于65 ℃烘干至恒重；地下部分清洗干净后在105 ℃杀青30 min 后，于65 ℃烘干至恒重；最后称地上、地下干重，计算生物量，换算成g·m-2，并计算根冠比。

根系形态：采用根系分析系统（WinRHIZO，REGENT，加拿大）进行各处理单株苜蓿根系形态扫描，获得单株总根长、根颈直径。

1.3.2生理指标 紫花苜蓿形态生长指标测定同期，每个混播处理下取4 盆，将每盆中紫花苜蓿新鲜叶片和全部根颈部位分别剪下，清洗干净，用滤纸吸干表面水分，用锡箔纸包裹投入液氮中，带回实验室转入-80 ℃低温冰箱冷冻保存。可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定［16］；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250 法测定［16］；游离脯氨酸含量采用茚三酮比色法测定［16］。

1.4 紫花苜蓿生长生理特性综合评价

应用Fuzzy 数学隶属函数法对不同混播比例下紫花苜蓿生长生理特性进行抗寒性综合评价，其公式如下：

式中：X为紫花苜蓿某一指标的测定值，Xmin，Xmax分别为各处理下此指标的最小值和最大值，X1为各处理下此指标的隶属值；若指标与抗寒性呈负相关，则隶属函数值为1-X1；最后将各处理紫花苜蓿各指标的隶属值相加，求出平均值后进行比较，平均值越大表明植物抗寒适应性越强［11］。

1.5 数据处理

采用SPSS 22.0 对不同紫花苜蓿占比下各生长和生理指标进行单因素方差分析，并用Duncan 法进行多重比较（α=0.05）；采用Excel 2016 和Origin 2018 对试验数据进行整理和制图。

2 结果与分析

2.1 紫花苜蓿生长特征

15 ℃阶段，相比MS100%，MS70%、MS50%和MS30%紫花苜蓿株高分别降低20.1%、34.0%和21.0%（P<0.05），而分枝数分别提高18.4%、34.0%和28.2%（P<0.05）；5 ℃阶段，紫花苜蓿株高随其占比减少呈增加趋势，且MS30%分别较MS100%和MS70%高25.8%和28.4%（P<0.05）；MS50%的紫花苜蓿分枝数最高，较MS100%提高28.1%（P<0.05）（图2）。

图2 2 个温度阶段紫花苜蓿在不同混播占比下的株高和分枝数Fig.2 Plant height and branch number of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

15 ℃阶段，紫花苜蓿叶长和叶宽在各处理下差异均不显著（P>0.05）；5 ℃阶段，MS70%、MS50%和MS30%紫花苜蓿叶长分别较MS100%高28.2%、35.5%和25.5%（P<0.05），而叶宽分别比MS100%低18.2%、24.7%和14.5%（P<0.05）。15 ℃阶段，MS70%的紫花苜蓿叶宽长比明显低于MS30%（P<0.05）；5 ℃阶段，MS70%、MS50%和MS30%紫花苜蓿叶宽长比分别较MS100%降低35.7%、44.3%和30.0%（P<0.05）（图3）。

图3 2 个温度阶段紫花苜蓿在不同混播占比下叶长、叶宽和叶宽长比Fig.3 Leaf length，width and width/length of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

15 和5 ℃阶段，各组分地上生物量均随各自占比的增加而增加，总生物量变化为：MS50%>MS30%>MS70%>MS100%，表现出明显的混播优势。15 ℃阶段，MS50%的地上总生物量分别较MS100%、MS70%和MS30%提高173.4%、62.5%和8.6%（P<0.05）；5 ℃阶段，MS50%地上总生物量最高，分别较MS100%、MS70%和MS30%提高169.8%、36.7%和6.9%（P<0.05）（图4）。

图4 2 个温度阶段及不同混播占比下牧草地上生物量Fig.4 Aboveground biomass of forage at two temperature stages under different mixed proportion

15 ℃阶段，MS50%紫花苜蓿根颈直径为2.1 mm，较MS100%和MS70%分别增大46.8%和21.4%（P<0.05）；5 ℃阶段，紫花苜蓿根颈直径随其占比降低依次增加，MS50%和MS30%显著高于MS70%和MS100%（P<0.05）。15 ℃阶段，随紫花苜蓿占比减少其主根长度增加，MS30%紫花苜蓿主根长度分别较MS100%和MS70%长22.1%和12.1%（P<0.05）；5 ℃阶段，MS50%分别较MS100%和MS70%长29.2%和28.4%（P<0.05）（图5）。

图5 2 个温度阶段紫花苜蓿在不同混播占比下根颈直径和主根长度Fig.5 Root collar diameter and tap root length of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

15 和5 ℃阶段，MS70%、MS50%和MS30%下紫花苜蓿地下生物量均显著高于MS100%处理（P<0.05）；垂穗披碱草地下生物量随紫花苜蓿占比的减少而增加；总地下生物量表现为：MS50%>MS30%>MS70%>MS100%。其中，15 和5 ℃阶段，MS50%下地下总生物量均最高，分别为67.64 和92.31 g·m-2，显著高于MS100%和MS70%处理（图6）。混播群落中紫花苜蓿根冠比随其占比的减少而增加。其中，15 ℃阶段，MS30%根冠比最高，为0.60，显著高于其他处理（P<0.05）；5 ℃阶段，MS30%紫花苜蓿根冠比为0.65，较MS100%增加58.5%（P<0.05）（图7）。

图6 2 个温度阶段及不同混播占比下牧草地下生物量Fig.6 Underground biomass of forage at two temperature stages under different mixed proportion

图7 2 个温度阶段紫花苜蓿在不同混播占比下根冠比Fig.7 Root/shoot of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.2 紫花苜蓿可溶性糖含量

15 和5 ℃阶段，叶片和根系可溶性糖含量均在MS50%最高。其中，15 ℃阶段，MS50%叶片可溶性糖含量为3.63%，显著高于其他3 个播种比例，根系可溶性糖含量于MS70%、MS50%和MS30%分别较MS100%提高13.1%、25.2%和14.0%（P<0.05）。5 ℃阶段，叶片和根系可溶性糖含量在MS50%分别为9.58%和12.0%，均显著高于其他3 个播种比例（P<0.05）（图8）。

图8 2 个温度阶段紫花苜蓿在不同混播占比下可溶性糖含量Fig.8 Soluble sugar content of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.3 紫花苜蓿可溶性蛋白含量

15 ℃阶段，随紫花苜蓿占比减少，叶片中可溶性蛋白含量增加，MS30%和MS50%分别为9.88 和9.51 mg·g-1，较MS100%分别高26.5%和21.6%（P<0.05），根系可溶性蛋白含量在各紫花苜蓿占比下无差异（P>0.05）；5 ℃阶段，叶片可溶性蛋白含量以MS50%最高，为24.35 mg·g-1，较MS100%高23.3%（P<0.05），根系可溶性蛋白含量在MS50%和MS30%较高，分别较MS100%显著高69.1%、56.7%（P<0.05）（图9）。

图9 2 个温度阶段紫花苜蓿在不同混播占比下可溶性蛋白含量Fig.9 Soluble protein content of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.4 紫花苜蓿脯氨酸含量

15 ℃阶段，叶片脯氨酸含量在MS50%最高，为4.22 mg·g-1，较MS100%高28.7%（P<0.05），根系脯氨酸含量随紫花苜蓿占比降低而增加，以MS30%下最高，为5.05 mg·g-1，较MS100%显著高32.9%（P<0.05）；5 ℃阶段，随紫花苜蓿占比降低，叶片脯氨酸含量上升，MS30%最高，为7.91 mg·g-1，分别较MS100%和MS70%高33.2%和29.9%（P<0.05），根系脯氨酸含量以MS50%最高，分别较MS100%和MS70%高38.0%和27.4%（P<0.05）（图10）。

图10 2 个温度阶段紫花苜蓿在不同混播占比下脯氨酸含量Fig.10 Proline content of alfalfa at two temperature stages under different mixed proportion

2.5 紫花苜蓿综合抗寒评价

从生理指标的变化看紫花苜蓿根系较叶片敏感，因而此处选择各紫花苜蓿占比下紫花苜蓿的生长表型和3 个根系生理指标进行综合评价其抗寒性。结果表明，各紫花苜蓿占比下苜蓿的抗寒性有所不同。MS50%处理下隶属值最高，为0.62，综合抗寒性最强；其次为MS30%，隶属值为0.53；MS100%处理的隶属值最小，为0.26，抗寒性最差，即随紫花苜蓿占比降低，紫花苜蓿的抗寒性能提高，本研究中紫花苜蓿在混播群落占比30%~50%时，对低温的适应性提高，抗寒性能提升（表1）。

表1 不同紫花苜蓿占比下各指标综合评价隶属值Table 1 Comprehensive evaluation membership value of each index under different proportion of alfalfa

3 讨论

3.1 混播比例对低温下紫花苜蓿生长及产量的影响

豆-禾混播作为理想栽培模式，在形态、生长发育方面的互补优势下，牧草生长形态及产量在不同生态区域表现出对环境的适应性［17-19］。本研究中，随生长温度从15 ℃降低到5 ℃，混播群落中紫花苜蓿的株高、分枝数、叶长及主根长未受明显抑制，其叶宽、叶宽长比和根颈直径等减小，这与前人在紫花苜蓿单播时的研究结果相吻合［20-22］；但本研究紫花苜蓿在占比30%~50%下表现较优，这与前人在部分低海拔、高纬度寒冷地区的研究结果相似。以往寒冷地区的研究表明，在加拿大紫花苜蓿以11%~33%占比与山丹雀麦（Bromus riparius）混播时的群落产量较单播显著提高16%~32%［23］，在吉林省紫花苜蓿以50%占比与羊草（Leymus chinensis）混播时群落产量较单播提高33%［24］，松嫩腹地紫花苜蓿与羊草混播占比各为50%时，其叶面积和生物量分别较单播提高46%和96%［25］；在部分温带地区，紫花苜蓿占比≥50%时，群落生长表现出较强的环境适应性，如内蒙古西辽平原紫花苜蓿与3 种禾草混播和美国西部地区紫花苜蓿与4 种禾草混播时，紫花苜蓿占比为67%~75%的群落产量最高［26-27］。说明紫花苜蓿与禾草的混播比例在寒冷和温带地区具较大差异性，其可能原因是温度可通过调控合理混播比例来实现组分对资源的充分利用，进而提高混播牧草生长对环境的适应能力。

3.2 混播比例下紫花苜蓿生理特性对低温的响应

豆-禾混播合理搭配不仅在形态、生长发育方面存在互补，而且在营养资源利用方面也具有较好的互补性，可以通过优化养分利用来提高牧草对生境的适应性［28-29］。如寒冷胁迫下，植物积累更多渗透调节物质来抵御寒冷环境［16］。本研究中，随温度降低混播较单播紫花苜蓿根系和叶片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量明显上升，根系上升幅度更大，对紫花苜蓿安全越冬贡献更大。不同混播比例紫花苜蓿根系对低温胁迫的贡献不一，其中以紫花苜蓿占比50%时贡献最大，且5 ℃阶段均比15 ℃阶段约高出1 倍；黄丽琴等［30］报道，紫花苜蓿占比33%与禾草混播时，紫花苜蓿根系可溶性糖含量最高；申晓慧等［31］以不同品种紫花苜蓿占比30%与草地羊茅混播，紫花苜蓿根系可溶性糖、可溶性蛋白及游离脯氨酸含量均随温度降低而增加，均于最冷月（11 月中旬）达最大值，且与单播处理差异显著。说明低温环境下，紫花苜蓿与禾草混播对紫花苜蓿根系抗寒物质积累有重要影响，通过提高紫花苜蓿根系抗寒渗透调节物质的大量积累，降低其根系细胞质溶液的凝固点，以有效防止细胞液凝结形成小冰晶对其产生伤害作用，进而提高其抗寒性能［11］。因此，紫花苜蓿与禾草混播具明显抗寒优势。

3.3 紫花苜蓿抗寒性综合评价

抗寒性是植物在寒冷环境长期适应中通过本身遗传变异和自然选择获得的一种抗寒能力，有许多其他重要的因素控制植物抗寒性［32］，仅凭单一生理指标无法全方位反映植物抗寒性［33-34］。因此，评价植物抗寒性不仅需选择适宜指标，更需科学准确的评价方法。当前评价植物抗寒性常用方法主要有隶属函数法、主成分分析、聚类分析法等，其中，隶属函数法能全方位筛选出与抗寒性显著相关的关键指标，揭示不同植物间抗寒性差别，已广泛运用于老芒麦（Elymus sibiricus）［35］、垂穗披碱草［36］、燕麦（Avena sativa）［37］、红三叶（Trifolium pratense）［38］等的抗寒抗旱性研究中。本研究运用隶属函数法，从紫花苜蓿形态及根系生理角度，综合分析不同紫花苜蓿占比下紫花苜蓿的抗寒性，得出混播群落中紫花苜蓿占比30%~50%下其对低温具较好适应性。

4 结论

紫花苜蓿与垂穗披碱草混播较单播更能提升紫花苜蓿的抗寒性，且不同紫花苜蓿占比下紫花苜蓿形态生长和生理特征对低温的适应性不同。随生长过程中温度的持续降低，紫花苜蓿较低占比下其株高、分枝数、根颈直径、主根长度、生物量等具较好低温适应性，同时可积累更多可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等渗透调节物质来抵御严寒，保证生长。综合评价得出，紫花苜蓿占比50%下其抗寒性最强，其次是30%处理。因此，30%~50%的紫花苜蓿与垂穗披碱草混播，是研究区紫花苜蓿-禾草混播草地建植较适宜比例。