乳腺癌筛选差异表达的miRNAs-mRNA及其与靶基因的关系

刘海英，陈 峰，王 梅，姚 嘉

乳腺癌是威胁全球女性健康的主要恶性肿瘤，发生于乳腺上皮或导管上皮[1-2]。其病因复杂，可能与遗传和环境有关[3]，约90%的患者由于肿瘤复发及体内扩散导致死亡[4]。因此，亟需寻找新的生物学标志物。微小RNAs(miRNAs)能够通过抑制信使RNA (mRNA) 翻译或促进mRNA降解，在转录后水平调节基因表达[5-6]。miRNAs参与调控细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭等多种生物代谢过程[7]。研究证明，miRNA能够调节肿瘤的侵袭和转移[8-9]，包括miR-122[10-11]、miR-767[12-13]、miR-449a[14-15]和miR-133b[16-17]等。上述miRNAs能够靶向不同的基因，调节乳腺癌的发生、转移和耐药[18]。目前，肿瘤组织中miRNAs与靶基因的作用机制是研究的热点。因此，本文着重探讨乳腺癌组织与癌旁组织中miRNA的表达，筛选显著差异表达的miRNAs-mRNA，并在细胞水平验证miRNAs与靶基因的作用关系。

1 材料与方法

1.1 材料Trizol(15596026)购自Ambion公司；DNase/RNase-Free Water(R1600)购自Solarbio公司；重组人胰岛素溶液(PB180432)购自普诺赛公司；Lipofectamine 2000(VB459270)购自上海一基公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027)购自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 乳腺癌细胞CCD-1095Sk、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、T-47D和ZR-75-1，购自中科院细胞库。将细胞取出置于37 ℃水浴中，待完全融化，加入4 mL完全培养基，400g离心3 min，弃上清，悬浮于1 mL培养基中，转移至培养瓶中，加入4 mL 完全培养基，置于37 ℃、5%CO2的培养箱内培养。

1.2.2差异表达miRNAs的筛选及靶基因确定 利用肿瘤基因组图谱(TCGA)获取1 034例导管和小叶肿瘤/原发性肿瘤的miRNA表达和102例正常组织的转录组，对数据进行整理分析。综合文献报道[10-17]筛选4种表达差异显著的miRNAs。通过对miRNA进行靶基因预测，结合GO和KEGG分析确定4种miRNAs所涉及的靶基因。

1.2.3qRT-PCR检测 取1×106个细胞加入1 mL Trizol中，提取总RNA。……