长非编码RNA-LUNAR1在成人急性T淋巴细胞白血病中的表达特征及预后相关性*

任建敏，尤伟波，许能文，张小耀，李琳洁（丽水市中心医院 .检验科，.血液科，.康复科，浙江丽水 323000）

成人急性T淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia，T-ALL）是一类常见的急性白血病［1］。虽然初治T-ALL患者缓解率可达55%～70%，但绝大多数患者复发，最终只有25%～30%可治愈［2-3］。从机制上寻找T-ALL 复发耐药的根源是深入解析白血病复发耐药原因的关键。一项在《Cell》杂志发表的急性T 淋巴细胞白血病RNA测序（RNA-seq）研究发现，在急性T细胞淋巴细胞白血病中存在高度特异性表达的长链非编码RNA-LUNAR1（leukemia-induced noncoding activator RNA，LncRNA-LUNAR1）［4］，位 于15q26.3，是于胰岛素样生长因子受体（insulin-like growth factor receptor，IGFR）基因附近的1个非编码RNA，其mRNA由491个核苷酸组成，包含有4个外显子和1个Poly（A）。研究表明，LUNAR1上调可以预测小儿T急性淋巴细胞白血病的不良预后［5］。本研究旨在检测成人T-ALL患者体内LncRNA-LUNAR1的表达水平，分析LUNAR1在参与T-ALL的复发耐药过程中可能存在的调控机制。以期为进一步针对T-ALL复发耐药的药物开发提供潜在的分子靶标。

1 材料和方法

1.1 研究对象 收集2014年1月至2019年12月丽水市中心医院血液科就诊的34例初发T-ALL的患者、19例T-ALL复发患者。其中初发T-ALL组：男20例，女14例，年龄28～71岁，中位年龄37 岁；T-ALL复发组：男11例，女8例，年龄33 ～67岁，中位年龄44 岁。另收集同期门诊检查的体检健康者25例患者作为健康人对照，男11例，女14例，年龄17～65 岁，中位年龄 42 岁；健康人对照组、T-ALL初发组和复发组在性别构成比例、BMI、年龄间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。T-ALL诊断及分型均根据WHO 2016 标准［6］。初发组纳入标准：（1）急性淋巴细胞白血病诊断确诊的患者；（2）均经分子生物学及免疫分型检查确诊者；（3）未接受激素、化疗药物等治疗者；（4）初次确诊者。复发组纳入标准：（1）符合《急性白血病的WHO最新分类诊断标准》［5］中关于复发急性淋巴细胞白血病诊断标准。排除标准：（1）严重贫血者；（2）严重出血者；（3）预计生存期小于2 个月者；（4）存在其他恶性肿瘤者等。本研究经丽水市中心医院医学伦理委员会批准［临床研究审（2016）第（48）号］，各研究对象知情同意。

1.2 主要仪器及试剂 TRIzol 试剂、逆转录试剂盒、100 mg／mL 链霉素和 100 U／mL 青霉素 （大连TaKaRa公司），Ficoll淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技公司），荧光定量 PCR 反应体系（PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix，美国 Applied Biosystems公司），RPMI-1640 培养基（美国 Invitrogen 公司），胎牛血清（美国Hyclone 公司），去甲氧柔红霉素（美国辉瑞制药公司），细胞周期分析试剂盒（上海碧云天生物技术公司）。NanoDrop One超微量紫外分光光度计（北京龙跃生物科技发展公司），FACSCanto流式细胞仪（美国 BD 公司），ABI 7500 循环仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.3 细胞分离 用EDTA-K2抗凝管收集治疗前T-ALL患者骨髓液2～4 mL，按照Ficoll淋巴细胞分离液试剂说明书分离单个核细胞。

1.4 RNA提取与实时定量荧光PCR 取上述各研究对象约3×106个PBMC，使用 TRIzol试剂抽提总RNA，NanoDrop One 超微量紫外分光光度计检测RNA 样本吸光度（A）值，取 A260nm／A280nm值为 1.8 ～2.0的样本用于后续试验。RNA样本置于－80 ℃保存。按照逆转录试剂盒说明书操作将2 μL RNA样本逆转录为cDNA，样本置于－20 ℃保存。使用Power SYBR Green进行实时定量荧光 PCR 分析，以GAPDH为内参照。使用Primer 3在线引物设计软件进行引物设计，LUNAR1 和GAPDH 的PCR 引物参照［7］，并由上海铂尚生物科技公司合成。LUNAR1上游引物序列：5′-CTCTTAAGTGAGGGCTC TCCT-3′，下游引物序列：5′-TTGTCTCCGCCAGGAG ATATCA-3′；GAPDH 上游引物序列：5′-TGGTCTGT ATTGTCAACGGATT-3′，下游引物序列：5′-AGTGGC AGTGATGTCTTCTGG-3′。荧光定量PCR反应体系20 μL：包括 PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL，10 μmol／L 上、下游引物各 0.6 μL，cDNA 模板 0.3 μL，灭菌去离子水 8.5 μL。反应条件：94 ℃预变性 60 s；94 ℃ 变性 15 s，60 ℃ 延伸 60 s，共 40个循环。LncRNA-LUNAR1 于 60 ℃时使用 High Resolution Melt（HRM）Software v3.0，1 软件采集荧光信号，并分析熔解曲线。使用2－△△Ct法计算和归一化LUNAR1 的相对表达量。每个样本均设3个复孔，计算其均值。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡（Annexin V／PI法）将上述复发组分离的单个核细胞200 μL接种于6 孔板，各孔含 5 ～10×105个细胞。以 LUNAR1 基因表达值的中位数定义高、低表达组。分别加入5 nmol／L去甲氧柔红霉素（idarubicin，IDA），以不加药作为空白对照组（细胞悬液），置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中温育18 h 后收集细胞，用PBS洗涤 2 次。重悬于 200 μL Binding Buffer 中，按照如下分管要求加入4 μL 0.5 mg／mL PI和2 μL Annexin V-FITC溶液。空白管：不加染料；2个单染管：只加 PI 和 Annexin V-FITC；实验管：加入 PI 和Annexin V-FITC；阴性管：空白对照组加入PI和Annexin V-FITC。室温避光温育15 ～20 min。结果判断：左下象限显示活细胞，为（FITC A-／PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC A＋／PI＋）；而右下象限为凋亡细胞，为（FITC A＋／PI-）。

1.6 数据库分析 下载 NCBI GEO 数据库（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／）中的 GSE57982数据集及GSE110633数据集。分别对CUTTL1T急淋细胞系敲低LUNAR1或者IGF1R基因的RNA-seq数据以及60例T-ALL患者的白血病细胞表达谱进行分析，获得T-ALL相关的RNA-seq原始数据以及患者资料信息。以RACE 得到的LUNAR1 全长信息作为LUNAR1 基因的表达区域，使用 STAR［8］比对分析软件和HT-seq［9］表达分析软件计算各个样本中LUNAR1基因的RPKM值，并根据数据量对这个数值进行归一化，从而得到每个患者样本中的LUNAR1的绝对表达数值。同样使用COX 回归分析比较 LUNAR1 基因高表达水平组（前 25%）与LUNAR1基因低表达水平组（后25%）中患者的预后情况，分析LUNAR1的表达水平与预后风险的关系。

1.7 统计学分析 所有结果均为3 个独立实验的平均值（）。使用SPSS 软件包（21.0 版；SPSS，IBM，Armonk，USA）进行统计分析。统计显著性通过卡方检验或Student t检验进行。使用COX回归分析比较LUNAR1 基因高表达水平组与低表达水平组中患者的预后情况。使用Kaplan-Meier 法进行生存分析，并使用对数秩检验比较患者组之间的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓中 LUNAR1 基因的表达 初发成人T-ALL患者骨髓内 PBMC 中LncRNA-LUNAR1 的表达水平（5.61±2.75）显著高于健康人对照组（0.35±0.27），差异有统计学意义（t ＝ 6.39，P＜0.001）。进一步进行初发T-ALL 患者和复发T-ALL 组比较，结果发现复发 T-ALL 组患者骨髓内 PBMC 中LncRNA-LUNAR1的表达水平（23.95±9.79）亦显著高于初发 T-ALL 组（5.61±2.75），差异有统计学意义（t＝7.52，P＜0.001）。

2.2 LUNAR1 基因高表达抑制肿瘤细胞的凋亡分别使用柔红霉素处理LUNAR1 高表达组和低表达组骨髓分离淋巴细胞，结果表明，高表达LUNAR1组中T-ALL细胞凋亡比率较低表达LUNAR1 组显著降低（4.06% vs 10.70%，P＜0.05），见图 1。

图1 LUNAR1基因的表达对去甲柔红霉素处理后肿瘤细胞的凋亡的影响

2.3 LUNAR1的高表达提示T-ALL 患者预后不良使用 COX 回归分析比较 NCBI GEO 数据库GSE110633数据集中LUNAR1 基因高表达水平组与低表达水平组中患者的预后情况，结果证实，LUNAR1高表达与T-ALL 患者预后不良相关（HR ＝1.86，P ＝0.002）。见图 2。

图2 高、低表达LUNAR1的T-ALL患者的生存率曲线

3 讨论

随着测序技术的发展，大量疾病相关的LncRNAs被发现与报道，这些LncRNA在疾病发生、发展过程中扮演着重要的角色，并可以作为关键的生物学标志物用于疾病诊断、预测与治疗［7，10］。LUNAR1在多种恶性血液系统疾病和恶性肿瘤中异常表达，并可能通过细胞周期调控参与疾病的发生、发展［5，7］。本研究发现，LUNAR1 在初治成人T-ALL患者骨髓内淋巴细胞中高表达，且复发患者的表达水平显著高于初发患者，并证实LUNAR1 的高表达与T-ALL 的预后不良相关。进一步进行功能试验发现，LUNAR1 基因高表达能抑制肿瘤细胞的凋亡。故而笔者认为，LncRNA-LUNAR1 可作为诊断、预后和预测成人T-ALL治疗反应的分子生物学标志物。

有关LUNAR1 基因表达调控机制目前仍未完全阐明。有学者认为，LUNAR1 表达受IGF1R 基因座中高活性增强子控制［4］。LncRNA-LUNAR1 可以结合在IGF1R 的启动子和LUNAR1 自身的增强子上，招募RNA 聚合酶Ⅱ以及转录激活元件，活化IGFR1 基因的表达。Peng 等［7］证实 E2F1、cyclin D1和p21是弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者中LUNAR1 的功能靶点。此外，Qian 等［10］证实，LUNAR1通过miR-495-3p／MYCBP 轴加速结直肠癌进展。故而笔者比较了敲除 LUNAR1 基因以及IGF1R基因的RNA-seq 数据，发现尽管分别敲除LUNAR1基因和IGF1R 基因导致的调变基因有部分重叠，但是仍然存在大量不同的基因，提示了LUNAR1基因除了主要影响IGF1R 外还存在其他的靶基因。

本研究尚存在一些不足之处，例如，尚未对LUNAR1对成人T-ALL的诊断价值以及LUNAR1的表达与成人T-ALL 患者病理参数之间的相关性进一步分析。IGF1R 作为 LUNAR1 的潜在靶基因，GF1R是否与LUNAR1表达存在一定的相关性也需进一步证实。综上所述，本研究证实LUNAR1 可作为潜在分子标志物来筛查成人T-ALL 的发生以及评估患者预后情况。为提高成人T-ALL临床疗效，减少复发耐药研究提供实验依据。