山香圆叶提取物对文昌鸡生长性能、血清免疫和抗氧化功能以及肠道微生物的影响

宋文静 宋琼莉 邹志恒 陈小连 刘林秀 谭 佳 魏立民 熊平文 陶秀花 孙瑞萍 张 艳

(1.海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海口 571100；2.江西省农业科学院畜牧兽医研究所，南昌 330200；3.海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室，海口 570203；4.江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，南昌 330200)

为维护动物源性食品安全和公共卫生安全，遏制动物源细菌耐药等问题，农业农村部发布了第194号公告，实施促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)退出市场。随着禁抗时代的到来，养殖业面临着畜禽生产性能下降、死淘率升高、经济效益显著下滑等问题，抗生素替代产品研发是实现畜禽无抗养殖的重要突破口之一[1]。山香圆为省沽油科植物，广泛分布在中国南部地区，其叶味苦、性寒，为我国传统中草药。山香圆叶的主要有效成分为三萜类化合物、大柱烷类化合物、黄酮类化合物、酚酸类化合物[2]以及多糖类化合物[3]，这些成分使得三香圆叶具有清热解毒、利咽消肿、抗菌消炎、活血止痛、增强免疫的功效，临床上多用于脓肿、发热、溃疡、炎症等的治疗[4-5]。山香圆含片能显著降低小鼠感染金黄色葡萄球菌后的死亡率[6]，对腹腔注射醋酸所致小鼠疼痛和热板所致小鼠疼痛均具有非常显著的镇痛作用[7]。山香圆叶总黄酮对环磷酰胺致免疫低下小鼠的网状内皮系统吞噬功能、迟发性超敏反应、血清溶血素生成素生成均有增强作用；山香圆叶总黄酮可以调节小鼠的免疫功能[8-10]。山香圆叶提取物(Turpiniaefoliumextract，TFE)对大鼠佐剂关节炎具有抗炎作用[11]。目前，鲜有山香圆叶及TFE在家禽上的应用研究报道。因此，本试验旨在研究饲粮中添加不同水平的TFE对文昌鸡生长性能、血清免疫和抗氧化功能以及肠道微生物的影响，为进一步发挥山香圆叶的利用价值，改善食品安全和质量，促进畜禽养殖业的绿色健康可持续发展提供理论基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与材料

雌性文昌鸡由海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室提供。TFE含总黄酮119.75 mg/g，总多糖10.15 g/100 g，多酚100.90 mg/g。

1.2 试验设计

选取同一饲养条件下的42日龄健康状况良好、体重接近的雌性文昌鸡432只，随机分为4组，每组6个重复，每个重复18只鸡。对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂在基础饲粮中分别添加0.015%、0.030%、0.060% TFE的试验饲粮，试验期为42 d。试验期间文昌鸡自由采食，充足饮水。每天观察文昌鸡的采食、粪便和健康状况，免疫接种参照《文昌鸡饲养管理技术规程》(DB46/T 44—2011)的规定执行[12]。基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，其组成及营养水平见表1。

1.3 饲养管理

整个试验在江西省农业科学院畜牧兽医研究所试验鸡场进行，试验鸡在入舍前对整个鸡舍进行彻底清扫消毒，期间采用网上分栏笼养，每笼6只(单笼尺寸：75 cm×70 cm×40 cm)，自由采食和饮水，舍内温度在23～26 ℃，相对湿度在65%～75%，光照24 h/d(5 lx)，做好试验鸡死亡记录。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.4 测定指标

1.4.1 生长性能测定

饲养期间以重复为单位记录试验鸡的喂料量、剩余料量、初始体重和终末体重，以此计算试验鸡的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2 血清生化指标测定

在试验结束时，每个重复选择健康且体重相近的试验鸡2只，翅静脉采血分离血清(3 000 r/min离心15 min)，-20 ℃保存待测。

采用比色法在迈瑞BS-420全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)上测定血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)含量(试验盒购自中生北控股份有限公司)。

采用比色法在迈瑞BS-420全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)上检测血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量；在华卫德朗DR-200BS酶标分析仪(无锡华卫德朗仪器有限公司)上测定血清丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及总抗氧化能力(T-AOC)(试剂盒购于北京华英生物技术研究所)。

采用酶联免疫法在华卫德朗DR-200BS酶标分析仪(无锡华卫德朗仪器有限公司)上测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-1β(IL-1β)含量(试剂盒购于北京华英生物技术研究所)。

1.4.3 空肠形态结构观察和测定

对家禽实施安乐死(颈脱位法)，用无菌解剖剪剪开腹部，取出胃肠道器官，用吸水纸擦干表面血污，采集空肠约3 cm左右，用0.9%的无菌生理盐水清洗后固定于10%中性甲醛溶液中，制作石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色以检测肠道形态，测量空肠的绒毛高度(VH)和隐窝深度(CD)，计算绒毛高度与隐窝深度的比值(VH/CD)。

1.4.4 肠道微生物测定

迅速用灭菌细线将盲肠结扎，确保肠道内容物充足，剪下结扎的盲肠段，立即将内容物转入2 mL灭菌冻存管中，置于-80 ℃冰箱保存，待测。采用DNA提取试剂盒提取盲肠内容物中DNA，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳观察DNA条带，并检测提取DNA的纯度和质量，采用特异性引物(338F/806R)扩增16S rDNA的V3～V4区。338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′;806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR产物经琼脂糖凝聚电泳检测后,回收目的片段并纯化。构建MiSeq文库,并进行Illumina测序。建库和测序工作由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.5 数据处理与统计分析

数据用Excel 2007进行初步整理后，采用SPSS 19.0软件进行统计分析。组间数据使用单因子方差分析(one-way ANOVA)，组间差异显著再进行Duncan氏多重比较检验。以P<0.05作为差异显著的判断标准。结果以平均值和均值标准误表示。

2 结果与分析

2.1 TFE对文昌鸡生长性能的影响

由表2可知，试验开始时各组间初始体重无显著差异(P>0.05)。经过42 d的饲养试验，随着TFE添加水平的增加，终末体重呈显著线性升高(P<0.05)。TFE对ADFI无显著影响(P>0.05)，但0.015%、0.030%和0.060%组的ADFI与对照组相比分别提高了0.88%、2.40%和2.20%。与对照组相比，添加0.030%和0.060%的TFE显著提高了ADG(P<0.05)。随着TFE添加水平的增加，F/G呈显著线性和二次曲线变化(P<0.05)。

2.2 TFE对文昌鸡血清代谢指标的影响

由表3可知，随着TFE添加水平的增加，血清TP和GLB含量呈显著线性和二次曲线变化(P<0.05)。与对照组相比，饲粮中添加TFE对血清ALB、TC、TG和GLU含量无显著影响(P>0.05)。

2.3 TFE对文昌鸡血清免疫指标的影响

由表4可知，与对照组相比，添加0.030%和0.060% TFE显著提高了血清IgA和IgG含量(P<0.05)。随着TFE添加水平的增加，血清IgM含量呈显著线性增加(P<0.05)。

表2 TFE对文昌鸡生长性能的影响

表3 TFE对文昌鸡血清代谢指标的影响

表4 TFE对文昌鸡血清免疫指标的影响

2.4 TFE对文昌鸡血清抗氧化指标的影响

由表5可知，与对照组和0.015%组相比，添加0.060% TFE显著提高了血清T-AOC和SOD活性(P<0.05)。与对照组相比，不同添加水平的TFE均显著提高了血清GSH-Px活性(P<0.05)。饲喂0.030%和0.060% TFE的文昌鸡血清MDA含量显著低于对照组(P<0.05)。

2.5 TFE对文昌鸡血清炎症因子含量的影响

由表6可知，随着TFE添加水平的增加，血清IL-10、IL-1β、IL-6和TNF-α含量呈显著线性和二次曲线变化(P<0.05)。与对照组相比，添加0.060% TFE显著提高了血清IL-10含量(P<0.05)。与对照组相比，不同添加水平TFE均显著降低了血清IL-1β含量(P<0.05)。0.030%和0.060%组血清IL-6和TNF-α含量显著低于对照组(P<0.05)。

表5 TFE对文昌鸡血清抗氧化指标的影响

表6 TFE对文昌鸡血清炎症因子含量的影响

2.6 TFE对文昌鸡肠道组织形态的影响

由表7可知，与对照组相比，TFE对文昌鸡空肠VH、CD和VH/CD均无显著影响(P>0.05)，但随着TFE添加水平的增加，空肠VH和VH/CD呈显著线性和二次曲线变化(P<0.05)。

表7 TFE对文昌鸡空肠组织形态的影响

2.7 TFE对文昌鸡盲肠菌群的影响

2.7.1 TFE对文昌鸡盲肠菌群在门水平上相对丰度的影响

由表8可知，盲肠内容物菌群中门水平共检测出19个门，表中列出的为相对丰度较高的12个菌门。盲肠内容物主要菌门是拟杆菌门和厚壁杆菌门，占90%左右。随着TFE添加水平的增加，拟杆菌门相对丰度呈显著线性增加(P<0.05)。与对照组相比，0.060%组变形菌门相对丰度显著下降(P<0.05)，各组盲肠中其他菌门相对丰度无显著差异(P>0.05)。

表8 TFE对文昌鸡盲肠菌群在门水平上相对丰度的影响

2.7.2 TFE对文昌鸡盲肠菌群在属水平上相对丰度的影响

由表9可知，盲肠内容物菌群中主要菌属为拟杆菌属和理研菌属RC9肠道群，占盲肠内容物属水平相对丰度的50%～60%，表中列出的为相对丰度较高的10个菌属。与对照组相比，0.060%组盲肠内容物中粪肠杆菌的相对丰度显著提高(P<0.05)，0.060%组的乳酸菌属相对丰度显著高于其他各组(P<0.05)，各组盲肠中其他菌属相对丰度无显著差异(P>0.05)。

表9 TFE对文昌鸡盲肠菌群在属水平上相对丰度的影响

续表9项目ItemsTFE添加水平 Supplementation level of TFE/%0 (对照 Control)0.0150.0300.060SEMP值 P-value方差分析ANOVA线性Linear二次Quadratic瘤胃球菌科_UCG-014 Ruminococcaceae_UCG-0141.272.841.311.830.3150.2750.9620.906脱硫弧菌属 Desulfovibrio1.881.821.041.800.1420.1080.6900.174巨单胞菌属 Megamonas1.380.593.470.390.7190.4480.8030.598乳酸菌属 Lactobacillus0.67b0.84b0.91b1.73a0.1540.0490.0060.018

2.8 TFE最适添加水平

以TFE的添加水平为自变量X(0≤X≤0.60)，以二元有显著的指标为因变量Y，进行二次回归分析，结果如表10所示。TFE添加水平为0.054%、0.060%和0.045%时，F/G、血清MDA含量、盲肠变形菌门相对丰度最低。ADG，血清TP、GLB、IgA、IgG、IgM含量，血清T-AOC，血清SOD、GSH-Px活性，血清IL-10、IL-1β、IL-6、TNF-α含量，肠道VH、VH/CD，盲肠粪肠杆菌属和乳酸杆菌属相对丰度分别在TFE添加水平为0.051%、0.060%、0.060%、0.049%、0.060%、0.060%、0.060%、0.048%、0.045%、0.060%、0.059%、0.052%、0.049%、0.060%、0.060%、0.060%和0.060%时处于最大值。选取上述指标最大值时添加水平的平均值作为最适添加水平，即最适添加水平为0.056%。

表10 基于回归模型参数的TFE最适添加水平

3 讨 论

3.1 TFE对文昌鸡生长性能的影响

提高肉鸡生长性能对于养殖企业控制生产成本具有重要的意义，在本试验条件下，TFE能够提高文昌鸡的ADG，一定程度降低F/G，并且其效果与添加水平呈线性或二次曲线关系。TFE具有一定芳香气味，在饲粮中添加TFE对文昌鸡的ADFI有一定的提高效果，但不显著，说明TFE的诱食效果不是提高文昌鸡生长性能的主要因素，ADG的提高和生长性能的改善可能是同样饲粮摄入量条件下营养物质(蛋白质、脂肪等)吸收、沉积增加的原因。植物提取物中的活性成分进入胃肠道后可以保护肠上皮抵御内毒素的危害，维持肠道屏障功能，并通过调节消化酶活性促进营养物质的吸收[13]。TFE可以改善文昌鸡肠道形态，调节肠道微生态，进而提高机体对营养物质的消化利用率。此外，TFE中的小分子活性成分如黄酮[14]、多酚[15]、多糖[16]等对动物的生长均有促进作用。TFE对文昌鸡的促生长作用与其添加水平呈线性和二次相关，这可能与其添加水平不同时活性成分如黄酮等含量不同有关，黄酮类化合物摄入含量不同时，其在机体内的代谢途径和作用方式存在差异[17-18]。

3.2 TFE对文昌鸡血清代谢指标的影响

血清生化指标可以反映动物机体的健康状况。血清TP、ALB、GLB含量可以反映机体蛋白质的吸收和代谢状况，TP、ALB、GLB含量升高，说明机体合成蛋白质能力较高，免疫功能良好。在本试验条件下，血清TP和GLB含量随着TFE添加水平的增加呈显著线性和二次曲线上升，表明TFE可以在一定程度上提高文昌鸡机体蛋白质的合成能力，保持机体代谢水平和免疫功能处于良好的状态。血清中的TG、TC含量是反映机体脂质代谢水平的指标。TG可被水解为脂肪酸，为组织提供能量。GLU是反映机体糖代谢水平的指标。在本研究中，饲粮中添加TFE对文昌鸡血清TC、TG、GLU含量无显著影响，提示TFE不影响文昌鸡脂质和糖代谢。

3.3 TFE对文昌鸡血清免疫功能的影响

免疫球蛋白IgA、IgG、IgM是由B淋巴细胞产生的特异性蛋白，其能够活化补体，清除病原体，是反映机体体液免疫水平的重要指标[19-20]。当机体处于免疫抑制状态时，免疫相关基因表达会下调，血液免疫球蛋白含量会下降，从而提高机体对疾病的易感性，降低动物生张性能。多种植物提取物被证实有提高机体免疫功能的作用，艾蒿水提物分刺激体外培养的淋巴细胞，结果显著增加了淋巴细胞培养液中IgM含量[21]。含黄酮19%的飞机草提取物可显著提高肉鸡血清中IgM和IgG含量[22]。总黄酮含量20.51%的桑叶提取物可显著增加断奶仔猪血浆中IgA和IgM含量[23]。纯度97%的桑黄多糖提取物可显著增加蛋鸡血清中IgA、IgM和IgG含量[24]。本研究表明，TFE提高了文昌鸡血清IgA、IgG含量，可见TFE对文昌鸡的体液免疫具有促进作用，发挥作用的主要有效成分可能是其中的黄酮、多糖等。本研究结果与前人研究结果存在一定出入，这可能是由于饲养时间、动物品种、添加水平等原因，此外，植物黄酮化合物因来源的植物不同而不同，功能也可能不尽相同。

细胞因子作为评估机体细胞免疫能力的另一重要指标，在免疫应答中发挥关键性作用。炎症反应在机体抵御外界感染和损伤中起调节作用，是机体重要的自我防御和修复机制，适度的炎症反应能够加快清除致炎物质，并且完成对受损组织的修复和再生，而过度的炎症反应不仅对正常组织和细胞的生理功能造成负面影响，并且可能产生级联反应对机体造成更大的损伤[25]。人为构建的应激、感染或炎症模型下，肉鸡的外周血单核细胞吞噬能力改变，其适应性T细胞反应发生变化，导致促炎因子如白细胞介素-17A(IL-17A)、TNF-α、IL-6、IL-1β等分泌，同时使抗炎因子白细胞介素-4(IL-4)、IL-10和干扰素-γ的分泌受阻[26-27]。实际集约化生产过程中，由于饲养密度较大，受环境中灰尘和病原体的影响，在无抗生素添加情况下，肉鸡极易发生呼吸道、消化道等炎症反应。多种植物提取物被研究证实能够通过抑制核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等信号通路，减少TNF-α和IL-1β等炎性介质的产生，提高抗炎因子IL-10等的分泌达到抗炎效果[28]。本试验条件下，TFE显著提高了血清IL-10含量，降低了血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。这说明TFE可以通过降低文昌鸡促炎性因子分泌，提高抗炎性因子含量，来减少机体炎症细胞浸润，改善机体组织损伤。

3.4 TFE对文昌鸡血清抗氧化功能的影响

机体细胞呼吸过程中会产生活性氧，正常情况下机体活性氧产生和清除处于动态平衡状态，但是当活性氧累积量超过机体对其清除能力时，活性氧的高活性和细胞毒性作用会导致机体损伤[29]。SOD和GSH-Px是体内重要的抗氧化酶，构成了机体酶促抗氧化体系是反映机体抗氧化能力的重要指标，T-AOC是反映机体抗氧化能力的综合指标，MDA是细胞膜脂质过氧化的终产物，可以衡量机体内氧化损伤程度，抗氧化剂系统可以防止脂质和蛋白质氧化引起的损伤，并保护机体免受细菌感染。多种植物提取物及其活性成分能够缓解应激状态下动物氧化损伤，提高非应激状态下动物机体抗氧化酶活性，其抗氧化作用明显受添加水平和处理时间的影响，车前子黄酮可显著提高氧化应激白羽蛋鸡血清中T-AOC，SOD、GSH-Px和过氧化氢酶(CAT)活性，并能降低血清中MDA含量[30]。小花棘豆黄酮能显著提高肉仔鸡肌肉组织和血清中SOD、GSH-Px、CAT和谷胱甘肽还原酶活性[31]。植物提取的抗氧化机制主要是通过直接清除或抑制自由基、提供质子和电子、中断氧化过程中的链式反应、抑制氧化酶活性、增强抗氧化酶活性、螯合起催化作用的金属离子、抗氧化成分之间互补和协同作用保护细胞免受氧化损伤[32-33]。本试验结果表明，TFE可以显著提高血清SOD、GSH-Px活性和T-AOC，可清除自由基，减少自由基和脂质过氧化产物对细胞膜的损坏，增强机体抗氧化能力。

3.5 TFE对文昌鸡肠道组织形态的影响

肠道黏膜是阻止病原体和食源性抗体入侵机体的第1道屏障，其良好的形态结构是保障营养物质消化吸收和抵御疾病风险的前提条件。小肠的组织形态一般通过对其绒毛和隐窝的组织学测定来进行评定，VH越高，其接触面积越大，对食糜中的营养物质吸收也越充分，CD越小表明肠上皮细胞越成熟，分泌功能越强，肠道的消化吸收能力越强[34]。刘靖[35]报道，博落回生物碱能够促进黄鸡小肠绒毛结构的发育，改善小肠的吸收功能，从而提高黄鸡的生长效率。本试验结果表明，TFE可以在一定程度上提高文昌鸡空肠VH和VH/CD，表明TFE可以改善文昌鸡肠道形态结构，提高肠道的消化吸收功能，该效果与其添加水平呈剂量依赖效应。

3.6 TFE对文昌鸡肠道微生物的影响

植物提取物的抗菌作用主要是通过破坏细菌细胞生物膜结构导致内容物释放，抑制细胞内酶活性，抑制DNA、RNA复制实现的[36]。研究发现，植物提取物对多种革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、肠球菌、单增李斯特、蜡状芽孢杆菌、链球菌和革兰氏阴性菌如大肠杆菌、弯曲菌、绿脓杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌和真菌黑曲霉、青霉、可可毛色二孢菌、尖孢镰刀菌白色念珠菌、镰刀菌等多种微生物具有抗菌活性，其抗菌效果取决于其浓度和作用时间[37-40]。植物提取物除了具有广谱抗菌活性，也能促进肠道有益微生物的生长[41]。连翘提取物可显著降低仔断奶猪肠道中大肠杆菌数量，提高乳酸菌和双歧杆菌数量[42]。通过代谢组学分析也表明了葡萄籽提取物对植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)增殖作用率较强[43]。植物提取物通过抑制有害菌的增殖，提高有益菌的丰度，维持肠道菌群平衡，提高肠道功能和减轻肠道疾病。本试验条件下，TFE可显著降低盲肠微生物中变形菌门相对丰度，显著提高粪肠杆菌属和乳酸菌属的相对丰度，其效果与添加水平呈线性或二次曲线关系。变形菌门包含多种病原菌如大肠杆菌、沙门氏菌等，其分泌物组胺[44]能够引起过敏或中毒反应[45]，与胃肠道疾病存在着密切关系[46]。粪肠杆菌属的分泌物水杨酸可以起到抗炎效果[47]，同时还可以产生丁酸调节T辅助细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)的分化，抑制组蛋白去乙酰化酶1的活性[48]，从而缓解肠道炎症，保持机体肠道健康。乳酸菌属菌类可以降低肠道pH，对于抑制有害菌群繁殖有一定作用，乳酸菌属菌类分泌的胞外多糖能够诱导结肠的抗癌活性，同时提高抗氧化酶活性，减少肠道脂质过氧化损伤[49]，肠道乳酸菌的增加有提高家禽(鸡、鸭)体重的效果，从而提高其生长性能[50]。从本试验结果可见，适宜添加水平的TFE可以抑制文昌鸡肠道有害微生物繁殖，提高肠道有益微生物的丰度，从而改善文昌鸡肠道微生态环境，提高文昌鸡生长性能。

4 结 论

饲粮中添加TFE能够增加文昌鸡ADG，提高血清免疫和抗氧化功能，改善空肠绒毛组织形态结构，调节盲肠微生态平衡，添加效果与添加水平呈剂量效应，经回归分析，推荐42～84日龄文昌鸡TFE最适添加水平为0.056%。