小柴胡汤联合抗菌药物对CRAB致腹膜炎/脓毒症大鼠模型的影响分析*

高 吟,张立红△,张志斌,周春刚,周永华

1.无锡市中医医院检验科，江苏无锡 214000；2.江苏省血吸虫防治研究所，江苏无锡 214000

脓毒症属于临床危重疾病，多伴随腹膜炎，该病在创伤、感染等应激状态下，损伤肠道的屏障功能，进一步导致肠源性感染及炎症性介质毒性网络的产生，造成肠道内大量的细菌和内毒素经门静脉及淋巴系统侵入血液循环，从而引起全身多器官功能衰竭[1-2]。腹膜炎/脓毒症的具体发病机制较复杂，其具有病死率高、并发症多等特征，内皮细胞、中性粒细胞、单核-巨噬细胞所释放的大量细胞因子、炎性介质均为该病发病过程的关键性物质[3]。耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)致腹膜炎/脓毒症大鼠模型是当前较常见的动物模型，具有建模效率高、操作方便等特征。当前有关西医治疗脓毒症的思路为对症治疗，包括水电解质平衡的维持、调节免疫、抗感染、清除炎症因子等，头孢哌酮/舒巴坦等均为脓毒症常用抗菌药物。西药治疗虽能降低病死率，但可导致机体出现耐药性，也伴随发生一定的不良反应[4]。随着中医药的不断发展和进步，中药治疗脓毒症取得了很好的效果，小柴胡汤由柴胡、生姜、大枣、黄芩、人参、半夏、甘草等组成，具有抗炎和增强人体免疫功能的作用，也可发挥解表清里的功效，使邪毒随糟粕排出体外[5-6]。本研究探讨与分析了小柴胡汤联合抗菌药物对CRAB致腹膜炎/脓毒症大鼠模型的影响，并简单阐述了其相关机制。

1 材料与方法

1.1材料来源 由无锡市中医医院SPF动物实验中心提供的清洁级3月龄雌性SD大鼠[体质量为(200.00±20.00)g]购自北京维通利华公司(动物质量合格证号SCXK2021-0006-152)。大鼠分笼饲养(每笼6只)，均进行标准大鼠饲料喂养，定期清除笼内异物，可自由饮食、饮水和活动，饲养条件是室温18～28 ℃，相对湿度62%～80%。

1.2仪器与试剂 小柴胡汤由兰州太宝制药有限公司提供(国药准字Z62021311)，酶联免疫吸附试验检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，CRAB由无锡市中医医院提供。亚胺培南购自浙江海正药业股份有限公司(国药准字H20070067)，头孢哌酮/舒巴坦购自湖南方盛制药股份有限公司(国药准字H20067077)，抗Notch-1抗体、抗端粒酶调节相关蛋白(TRAP)抗体、抗β-actin抗体购自美国Sigma公司。

1.3方法

1.3.1CRAB致腹膜炎/脓毒症大鼠模型的建立 CRAB在MHA平板上生长、传代，腹腔注射0.5 mL/20 g CRAB与5%猪粘蛋白到大鼠中，建立CRAB致腹膜炎/脓毒症大鼠模型。造模成功条件如下：(1)动物体温下降、休克等，且模型的自然死亡率>50%，死亡时间与模型制备时间间隔>12 h；(2)细菌血培养阳性；(3)各脏器病理出现炎性损伤、坏死等改变。

1.3.2模型分组与治疗 将36只CRAB致腹膜炎/脓毒症大鼠随机分为3组：模型组、西药组与联合用药组，每组12只。西药组给予皮下注射头孢哌酮/舒巴坦[240/120 mg/(kg·12 h)]+亚胺培南[156 mg/(kg·12 h)]，2次/天。联合用药组在西药组治疗的基础上给予小柴胡汤中药提取液[组方：柴胡30 g，黄芩、人参、半夏、甘草(炙)、生姜(切)各9 g、大枣(擘)4枚]0.3 mg/kg灌胃，2次/天。模型组每日灌胃生理盐水。3组均治疗观察7 d。

1.3.3观察指标 3组分别在治疗第3天与第7天处死6只大鼠，然后进行以下检测。(1)采用Kuebler方法检测肺组织的髓过氧化物酶(MPO)水平，可以有效评价肺组织中性粒细胞的渗出程度。大鼠右肺标本用滤纸吸去表面液体后称重，烤箱内加热72 h再称重，计算肺标本的干湿指数。(2)对大鼠心脏进行取血，离心(1 500 r/min离心10 min)后收集上清液，-80 ℃冰箱保存，采用酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平。(3)无菌条件下分离大鼠的部分脏器，4%甲醛固定进行HE染色。(4)分离大鼠的肺组织并研磨，进行总蛋白的提取，采用二喹啉甲酸(BCA)方法定量蛋白质水平。

2 结 果

2.1一般情况对比 模型组：大鼠躯体蜷缩，眼目不睁，活动减少，对刺激反应迟钝，精神萎靡嗜睡，被毛蓬松少光泽。西药组与联合用药组：大鼠的活动性、进食饮水状况、反应性均优于模型组。

2.2肺MPO水平与干湿指数对比 西药组与联合用药组治疗第3天与第7天的肺MPO水平及干湿指数均低于模型组(P<0.05)，联合用药组低于西药组(P<0.05)。见表1。

表1 3组治疗不同时间点的肺MPO水平及干湿指数对比

2.3血清炎症因子水平对比 西药组与联合用药组治疗第3天与第7天的血清TNF-α和IL-6水平均低于模型组(P<0.05)，联合用药组低于西药组(P<0.05)。见表2。

表2 3组治疗不同时间点的血清炎症因子水平对比

2.4Notch1、TRAP蛋白相对表达水平对比 西药组与联合用药组治疗第3天与第7天的肺Notch1、TRAP蛋白相对表达水平均低于模型组(P<0.05)，联合用药组低于西药组(P<0.05)。见表3。

表3 3组治疗不同时间点的肺Notch1、TRAP蛋白相对表达水平对比

3 讨 论

腹膜炎/脓毒症具有极高的发病率和病死率，其中肺脏由于肺循环滤过全身血液，肺组织内存在大量单核巨噬细胞，使之成为脓毒症发生时最易受损伤的器官。肠道在发生脓毒症时也易受到损伤，脓毒症可导致肠道细菌移位与肠道细胞凋亡，从而加重病情。同时腹膜炎/脓毒症可通过刺激淋巴组织导致免疫激活，继续损伤肠道黏膜，形成恶性循环，最终导致全身多脏器功能不全[7]。中医认为，脓毒症患者多毒邪外犯、壮热汗出、邪毒亢盛、邪正斗争剧烈，津液运化失司、瘀血阻滞脉络、大肠传导功能失常[8]。本研究结果显示，西药组与联合用药组治疗第3天与第7天的肺MPO水平及干湿指数低于模型组，联合用药组低于西药组，表明小柴胡汤联合抗菌药物在CRAB致腹膜炎/脓毒症大鼠模型中的应用能降低肺MPO水平与干湿指数。从机制上看，小柴胡汤为表里双解剂，功效为内泻热结、和解少阳。现代药理研究提示，柴胡的主要化学成分为糖类、黄酮类、皂苷类、香豆素类、挥发油类等，其具有良好的调节免疫功能与抗炎作用，可有效恢复脓毒症患者的免疫平衡[9]。黄芩含有黄酮类化合物、多糖、挥发油等各种成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等作用。小柴胡汤的应用具有保护肠黏膜屏障、抑制胰腺分泌磷脂酶A2等作用，对脓毒症的治疗也具有较好的前景。孢哌酮/舒巴坦+亚胺培南等抗菌药物，可抑制体内的病原体的细胞壁及细胞核的合成，进而抑制其繁殖，起到不可逆的抑制作用，且抗菌药物可迅速进入腹水达到杀菌浓度，进而发挥抗炎抗菌的作用。二者合用，可加强抗炎作用，并提高人体免疫功能[10-11]。

腹膜炎/脓毒症的发生机制目前仍未完全阐明，适量的炎症因子有利于机体正常防御反应，但炎症因子的大量释放则可产生广泛的损伤作用。TNF-α是机体受到有害刺激后最初分泌的细胞因子，可诱导IL-6表达，促使炎症细胞因子之间相互作用并形成正反馈环，诱发“级联效应”。IL-6的高表达可激活核转录因子κB，从而导致脓毒症进一步加重。有研究表明，TNF-α可由激活的中性粒细胞和巨噬细胞释放，而对各种免疫细胞和结构细胞产生刺激，进而诱导机体释放大量炎症介质，最终引起全身炎性反应[12]。本研究结果显示，西药组与联合用药组治疗第3天与第7天的血清TNF-α和IL-6水平低于模型组，联合用药组低于西药组，表明小柴胡汤在CRAB致腹膜炎/脓毒症大鼠模型中的应用可抑制炎症因子的表达。从机制上分析，小柴胡汤和抗菌药物二者联用除了可以抗炎和增强人体免疫功能，也能发挥肠道保护和减少细菌移位等作用，从而减轻全身炎性反应[13]。

Notch信号通路被发现可参与多种疾病的发生、发展，Notch-1是Notch受体的重要类型。当Notch信号通路被激活时，会增加Notch-1的表达，进而引发下游靶基因的激活。TRAP也是调节脓毒症发生、发展的关键因子，可调节破骨细胞的生成和活化，通过正反馈加重炎性反应，并促进炎症介质的大量释放。本研究结果显示，西药组与联合用药组治疗第3天与第7天的肺Notch1、TRAP蛋白相对表达水平低于模型组，联合用药组低于西药组，表明小柴胡汤联合抗菌药物在CRAB致腹膜炎/脓毒症大鼠模型中的应用可抑制Notch1、TRAP蛋白的表达。小柴胡汤可作用于线粒体中有氧呼吸的过程，进而影响机体能量代谢，从而缓解因脓毒症引起的微循环障碍。此外，小柴胡汤可从“神经-内分泌-免疫-代谢”等多层面影响脓毒症的发生与发展，从而对肺脏起到保护作用[14-15]。本研究也存在一定的不足，如未设置空白对照组，也未进行不同剂量的组别分析，笔者将在后续研究中探讨。

综上所述，小柴胡汤联合抗菌药物在CRAB致腹膜炎/脓毒症大鼠模型中的应用能抑制Notch1、TRAP蛋白的表达，抑制炎症因子的表达，从而降低肺MPO水平及干湿指数。