抗补体5a受体抗体对变应性鼻炎大鼠Treg/Th17免疫失衡的调控作用

刘玉娟,吴云霄,魏燕高△

杨凌示范区医院：1.耳鼻喉科；2.神经内科，陕西咸阳 712100

变应性鼻炎(AR)是一种I型过敏性免疫球蛋白E(IgE)依赖型鼻黏膜疾病，由吸入的过敏原包括尘螨、花粉和动物皮屑等引起[1]。AR对患者生活质量产生了较大影响，也给社会医疗服务造成了一定负担，现已成为全世界重大公共卫生问题[2-3]。目前，AR的发病机理尚未完全阐明。有研究表明，在多数情况下运用抗组胺药和皮质类固醇激素可以减轻AR症状[4]，但是，耐药性的产生使AR患者难以治愈。因此，迫切需要开发新颖且有效的药物来治疗AR。

补体C5a是活化的补体系统C5裂解后的小分裂片段产物，其能够促进炎症因子的释放，通过与特定的补体5a受体(C5aR)结合发挥作用，已有研究表明，C5a激活后参与多种疾病反应，例如系统性红斑狼疮、败血症、缺血再灌注损伤和类风湿关节炎等[5-7]。目前，靶向C5a和C5aR开发抗体以及小分子化合物已成为多种疾病的治疗靶点，其中，抗C5aR抗体是C5a拮抗剂，可抑制C5a的活性从而减轻炎性反应。为了探索抗C5aR抗体对AR的作用，本研究以构建的大鼠AR模型为研究对象，观察抗C5aR抗体施用后的效果，为临床AR的治疗提供实验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料来源 60只无特定病原体(SPF级)Wistar大鼠，雌雄各30只，4～6周龄，体质量160～220 g，由本院SPF级动物实验中心提供，饲养于标准动物环境条件下，实验期间自由饮水、摄食。

1.2仪器与试剂 抗C5aR抗体购自上海吉尔生物化学有限公司，Jagged1肽、卵清蛋白(OVA)和氢氧化铝[Al(OH)3]干粉购自美国Sigma公司，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所，HE染色试剂盒、PAS染色试剂盒和免疫组织化学染色试剂购自武汉博士德生物公司，抗体Notch1、Jagged1、RORγt、Foxp3购自美国Cell Signaling公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/山羊抗鼠和β-actin购自北京康为世纪生物科技有限公司，BCA蛋白检测试剂盒和增强化学发光法(ECL)发光液购自上海碧云天生物研究所。

1.3方法

1.3.1大鼠AR模型制备 建立Wistar大鼠AR模型，具体按照参考文献[8]方法操作。首先进行基础致敏，将0.3 mg OVA和30 mg Al(OH)3加入1 mL的生理盐水混合均匀，制成混悬液，通过腹腔注射，隔日注射1次，共注射7次，用时14 d，同时对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水；接着进行鼻腔激发，致敏后的大鼠取2%OVA进行滴鼻，采用微量进样器从鼻腔滴入，每侧滴入50 μL，每天1次，连续7 d，对照组以等量生理盐水滴入鼻腔。末次鼻腔激发后，进行表观行为学指标评估大鼠AR模型是否造模成功，观察30 min内大鼠喷嚏、鼻溢和搔鼻动作行为，采用叠加量化计分，具体为(1)喷嚏：1～4个为1分，>4～10个为2分，>10个为3分；(2)流鼻涕：流至鼻孔前为1分，流出鼻孔为2分，流至面部计为3分；(3)挠痒：单前肢偶有挠鼻为1分，双前肢挠鼻为2分，双前肢不停挠鼻为3分。叠加评分总分>5分，判断为造模成功。

1.3.2分组与给药 将60只Wistar大鼠按照随机数字表法分为4组，包括对照组、模型组、抗C5aR抗体组、抗C5aR抗体+Jagged1组，每组15只。除对照组外其余3组大鼠均建立AR模型，对照组予以生理盐水处理。造模完成后，抗C5aR抗体组大鼠腹腔注射20 μL抗C5aR抗体(10 μg/mL)，抗C5aR抗体+Jagged1组大鼠腹腔注射20 μL抗C5aR抗体(10 mg/kg)，同时注射5 μL Jagged1钛(10 μg/mL)，对照组和模型组注射等体积的生理盐水，每周注射1次，共持续4周。

1.3.3ELISA 断颈法处死各组大鼠，通过眼眶采血，将收集的血液静置于室温下2 h，接着以4 000 r/min离心15 min，分离血清，保存在-80 ℃冰箱中。使用大鼠特异性ELISA试剂盒检测血清中IgE、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-6、IL-10和IL-17的水平，步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.4HE染色 处死大鼠后分离鼻骨前皮肤，咬除鼻骨，取双侧鼻腔黏膜组织，迅速清洗干净，置于4%多聚甲醛中固定；将固定好的组织常规石蜡包埋，在切片机上切成5 μm的组织薄片，通过HE染色观察组织学改变。步骤包括：组织切片采用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，加入苏木精染色5 min，流水冲洗干净，再加入伊红染色3 min，流水再次冲洗干净，利用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，通过光学显微镜观察鼻腔黏膜组织形态变化，并随机选择6个不同视野观察计数嗜酸性粒细胞数目，取平均值作为结果。

1.3.5PAS染色 取制备的鼻腔黏膜组织石蜡切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，将切片置于阿利新蓝溶液中浸泡10 min，流水冲洗干净，置于过碘酸溶液中氧化5 min，接着浸入Leagene Schiff Reagent中染色10 min，流水冲洗后，通过Mayer Lillie苏木素染色液染核，酸性乙醇分化，加入氨水溶液返蓝，洗净后，再次进行脱水与透明处理，中性树胶封片，通过光学显微镜观察鼻腔黏膜组织染色情况，并随机选择6个不同视野观察计数杯状细胞数目，取平均值作为结果。

1.3.6免疫组织化学染色 鼻腔黏膜组织石蜡切片经过二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，置于0.3%过氧化氢中30 min，并通过高温(98 ℃)加热5 min进行抗原修复，接着加入山羊血清，室温孵育1 h，将切片与兔抗Notch1(1∶200)一抗工作液，在4 ℃共同孵育过夜。PBS缓冲液清洗，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)二抗工作液，在室温下孵育1 h，在切片上滴加 DAB 显色，自来水清洗干净，加苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片，在光学显微镜下观察组织中阳性表达并捕获图像，胞质染成黄色至棕色即为阳性，随机选择6个视野，采用Image-Pro Plus软件统计阳性表达面积。

1.3.7Western blot 将鼻腔黏膜组织充分剪碎，PBS缓冲液清洗干净，加入RIPA裂解缓冲液提取组织总蛋白，通过BCA法测定蛋白质含量。以30 μg各组蛋白样品加样，通过10% SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉中室温封闭2 h，TBST洗膜，加入RORγt(1∶1 000)、Foxp3(1∶1 000)、Notch1(1∶1 000)与Jagged1(1∶1 000)一抗工作液，以β-actin作为内参蛋白(1∶1 000)，4 ℃下孵育过夜。次日，TBST洗膜，加入对应的辣根过氧化物酶标记二抗工作液(1∶5 000)，室温下孵育1 h，TBST洗膜后，滴加ECL发光液显色曝光，凝胶成像系统拍照，Image Pro-Plus分析系统分析蛋白条带灰度值，计算各蛋白表达水平。

1.3.8流式细胞术分析外周血CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞)和CD4+IL-17A+辅助性T细胞17(Th17细胞)百分比 采集各组小鼠外周血，流式细胞仪检测Treg、Th17细胞比例，取肝素抗凝血，在避光条件下加入抗体，Treg细胞以CD4/Foxp3标记，Th17细胞以CD4/IL-17A标记，室温孵育15 min，接着加入500 μL裂解液，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，加入1.5 mL PBS缓冲液，置于离心机中以2 500 r/min离心10 min，弃上清液后加入PBS缓冲液轻轻混匀，立即通过流式细胞仪进行分析。

2 结 果

2.1建模后4组大鼠表观行为学评分比较 末次鼻腔激发后，4组大鼠30 min内喷嚏、鼻溢和搔鼻动作行为的评分结果见表1。对照组大鼠未见明显的喷嚏与流涕表现，偶有抓鼻；而模型组、抗C5aR抗体组和抗C5aR抗体+Jagged1组的大鼠均表现出烦躁不安，打喷嚏、流涕以及频繁抓鼻等现象，表观行为学评分均高于5分，且明显高于对照组(P<0.05)，说明AR模型构建成功。

表1 4组大鼠表观行为学评分比较分)

2.24组大鼠血清IgE水平比较 模型组大鼠血清中IgE水平明显低于对照组(P<0.05)；抗C5aR抗体组IgE水平较模型组明显升高(P<0.05)；抗C5aR抗体+Jagged1组IgE水平高于抗C5aR抗体组(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠血清IgE水平比较

2.34组大鼠血清IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-17水平比较 与对照组比较，模型组血清IFN-γ、IL-10水平明显下降，IL-6、IL-17水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，抗C5aR抗体组IFN-γ、IL-10水平明显升高，而IL-6、IL-17水平明显下降(P<0.05)；与抗C5aR抗体组比较，抗C5aR抗体+Jagged1组IFN-γ、IL-10水平明显下降，同时IL-6、IL-17水平明显升高(P<0.05)，见图1。

注：A～D分别为4组IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-17水平比较；与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与抗C5aR抗体组比较，&P<0.05。

2.44组大鼠鼻腔黏膜组织病理学变化比较 HE染色和PAS染色结果显示，对照组大鼠鼻腔黏膜组织结构整齐、排列有序，未发现组织损伤；模型组大鼠鼻腔黏膜组织可见明显的血管扩张、水肿和严重炎性细胞浸润，嗜酸性细胞粒数目和杯状细胞数目均明显增加；抗C5aR抗体组鼻腔黏膜组织仍有水肿，相较于模型组炎症细胞浸润程度减轻，嗜酸性细胞粒数目和杯状细胞数目均减少；而与抗C5aR抗体组相比较，抗C5aR抗体+Jagged1组鼻腔黏膜组织水肿和炎性细胞浸润较为严重，嗜酸性细胞粒数目和杯状细胞数目也表现为增加，见图2。

注：A为对照组大鼠鼻腔黏膜组织HE染色,B为模型组大鼠鼻腔黏膜组织HE染色,C为抗C5aR抗体组大鼠鼻腔黏膜组织HE染色,D为抗C5aR抗体+Jagged1组大鼠鼻腔黏膜组织HE染色,E为对照组大鼠鼻腔黏膜组织PAS染色,F为模型组大鼠鼻腔黏膜组织PAS染色,G为抗C5aR抗体组大鼠鼻腔黏膜组织PAS染色,H为抗C5aR抗体+Jagged1组大鼠鼻腔黏膜组织PAS染色。

2.54组大鼠鼻腔黏膜组织RORγt与Foxp3表达比较 Western blot检测结果显示，模型组鼻腔黏膜组织中RORγt蛋白表达较对照组明显上调，Foxp3蛋白表达则明显下调(P<0.05)；与模型组比较，抗C5aR抗体组RORγt蛋白表达明显下调、Foxp3蛋白表达明显上调(P<0.05)；而相较于抗C5aR抗体组，抗C5aR抗体+Jagged1组RORγt蛋白表达明显上调，Foxp3蛋白表达明显下调(P<0.05)，见图3。

注：A为对照组，B为模型组，C为抗C5aR抗体组，D为抗C5aR抗体+Jagged1组。

2.64组大鼠外周血Treg细胞和Th17细胞亚群比例分析 流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，模型组外周血中Th17细胞比例升高，Treg 细胞比例降低，Th17/Treg比值明显增加(P<0.05)；与模型组比较，抗C5aR抗体组Th17细胞比例降低而Treg 细胞比例升高，Th17/Treg比值明显下降(P<0.05)；而相较于抗C5aR抗体组，抗C5aR抗体+Jagged1组Th17细胞比例升高，Treg细胞比例降低，同时，Th17/Treg比值明显增加(P<0.05)，见图4。

注： A为对照组大鼠外周血中Th17细胞比例,B为模型组大鼠外周血中Th17细胞比例,C为抗C5aR抗体组大鼠外周血中Th17细胞比例,D为抗C5aR抗体+Jagged1组大鼠外周血中Th17细胞比例,E为对照组大鼠外周血Treg 细胞比例,F为模型组大鼠外周血Treg 细胞比例,G为抗C5aR抗体组大鼠外周血Treg 细胞比例,H为抗C5aR抗体+Jagged1组大鼠外周血Treg 细胞比例。

2.74组大鼠鼻腔黏膜组织Notch1-Jagged1信号途径相关蛋白表达比较 通过免疫组织化学染色结果可观察到，对照组鼻腔黏膜组织中染色较浅，Notch1蛋白阳性表达率为(8.50%±0.66%)；模型组中染色较深，Notch1蛋白阳性表达率为(38.03%±3.15%)，较对照组明显增加(P<0.05)；抗C5aR抗体组中染色明显变浅，Notch1蛋白阳性表达率为(8.47%±0.70%)，较模型组明显降低(P<0.05)；而抗C5aR抗体+Jagged1组染色又明显加深，Notch1蛋白阳性表达率为(43.55%±3.89%)，相较于抗C5aR抗体组明显增加(P<0.05)，见图5。

注：A为对照组大鼠鼻腔黏膜组织Notch1蛋白染色，B为模型组大鼠鼻腔黏膜组织Notch1蛋白染色，C为抗C5aR抗体组大鼠鼻腔黏膜组织Notch1蛋白染色，D为抗C5aR抗体+Jagged1组大鼠鼻腔黏膜组织Notch1蛋白染色。

Western blot检测结果显示，与对照组比较，模型组鼻腔黏膜组织中Notch1与Jagged1蛋白表达明显升高(P<0.05)；与模型组比较，抗C5aR抗体组鼻腔黏膜组织中Notch1与Jagged1蛋白表达则明显下降(P<0.05)；而抗C5aR抗体+Jagged1组Notch1与Jagged1蛋白表达较抗C5aR抗体组则明显升高(P<0.05)，见图6。

注：A为对照组，B为模型组，C为抗C5aR抗体组，D为抗C5aR抗体+Jagged1组。

3 讨 论

AR是由IgE介导的与过敏原免疫反应相关的鼻黏膜炎症疾病，AR患者通常以鼻塞、打喷嚏和鼻痒等症状为主要特征。在AR反应中，当过敏原与鼻腔黏膜接触后，肥大细胞通过分泌释放炎性介质如组胺、IL等，诱导急性过敏反应的发生；当在过敏原中持续暴露6～10 h后，鼻腔中会引发炎性细胞如嗜酸性粒细胞浸润，嗜酸性粒细胞来源的介质诱导上皮损伤并致使鼻腔黏膜肿胀[9]。如今，AR已影响全球10%～20%成年人的健康[3]，因此，了解AR的性质是改善该疾病的有效途径。本研究使用OVA和Al(OH)3诱导构建大鼠AR模型，在经过抗C5aR抗体治疗后发现，AR大鼠炎性反应及鼻腔黏膜组织病变现象均得到了明显改善。

补体系统是人体重要的免疫防御系统，活化后参与多种疾病的发生、发展，包括癌症、炎症及自身免疫性疾病等。该系统主要由血浆蛋白与膜蛋白组成，级联反应的激活通过3个主要途径的链式反应发生：经典途径、替代途径和凝集素途径，这些途径启动后最终形成C3、C5转换酶并产生过敏毒素C3a、C5a，它们主要通过与其相应的受体C3aR和C5aR结合来发挥作用[10]。其中，补体成分C5a是主要的促炎介质，该活性片段可激活中性粒细胞与巨噬细胞，合成并释放炎性介质而致使炎性反应的发生，其特异性受体C5aR也在单核细胞和巨噬细胞上表达。研究表明，C5a/C5aR相互作用导致中性粒细胞募集和巨噬细胞积累，并加剧多种炎症反应性疾病[11-12]。而以C5aR作为靶点开发补体C5aR单克隆抗体可有效治疗其介导的疾病。如抗C5aR抗体联合大蒜素对大鼠炎性肠病具有较好的治疗效果，可抑制炎性反应，提高动物生存率[13]。本研究结果显示，抗C5aR抗体对AR大鼠也有良好的治疗效果。

Th17细胞和Treg细胞是人类免疫系统的重要组成部分。Th17细胞代表促炎性T细胞的子集，可促进组织损伤和自身免疫病理损伤。IL-17是Th17细胞发挥生物学作用的主要细胞因子。相比之下，Treg细胞发挥免疫抑制作用，其功能障碍可能诱发自身免疫性疾病[14]。在生理条件下，Th17细胞和Treg细胞在动态平衡中互相拮抗，并参与维持机体正常的免疫状态。当Treg细胞数量减少或Th17细胞数量增加时，Th17/Treg失衡并诱导炎性反应[15-16]。本研究结果显示，AR发生后大鼠机体内Th17/Treg失衡，在经过抗C5aR抗体治疗后Th17/Treg趋于平衡状态。

Notch信号传导是一个保守且特征明确的途径，在动物发育、维持体内稳态和疾病中发挥关键作用，并介导细胞增殖、发育及分化。在哺乳动物中已发现了Notch信号的4个受体(Notch1～4)和5个配体(Jagged1～2和Delta-like 1、3、4)。Notch受体与其配体结合后，Notch信号通路被激活并催化Notch受体，导致Notch细胞内结构域(N-ICD)的释放。接着，N-ICD易位到细胞核中，并与共激活因子结合以介导下游基因的表达[17-18]。以往研究表明，Notch1-Jagged1信号途径在AR中被激活，Notch1可通过抑制Treg 细胞分化而调节Foxp3表达[19]。本研究结果同样显示，AR大鼠鼻腔黏膜组织中Notch1与Jagged1蛋白表达明显升高，使用抗C5aR抗体治疗后，组织内Notch1与Jagged1蛋白表达均下降。为了进一步验证抗C5aR抗体是否通过Notch1-Jagged1信号途径发挥作用，笔者通过联合使用抗C5aR抗体与Jagged1肽作用后发现其对AR大鼠未起到改善作用。由此推测，抗C5aR抗体可能通过调控Notch1-Jagged1信号途径在AR中发挥作用。

综上所述，抗C5aR抗体可能通过减轻炎性反应，调控RORγt与Foxp3蛋白表达，介导Th17/Treg平衡及抑制Notch1-Jagged1信号途径激活，从而对AR大鼠的症状起到一定的改善作用。然而，Notch信号通路与Hedgehog、Wnt、NF-κB、AKT/mTOR等多个信号通路交互作用参与细胞、组织、器官的分化与发育过程，在本研究中，给予Notch信号传导途径配体的Jagged1肽作用，是直接还是间接与抗C5aR抗体治疗产生拮抗作用还有待后续进行深入探究。